Summary
为了检验在Bicyclus anynana蛹右翼组织的基因表达，我们目前在使用riboprobes原位杂交优化协议。我们还提供指引，为进一步优化本议定书在其他鳞翅目物种蛹翅膀。
Abstract
在这里，我们目前，在视频格式，在原位杂交，在蝴蝶Bicyclus anynana的蛹翅膀使用riboprobes协议。原位杂交，发育生物学的重要支柱，是很有用的研究发展组织在转录水平的基因表达的空间和时间的模式。如果目标基因转录的蛋白产物的抗体，有尚未被开发，和/或有多个基因的拷贝无法区别使用可用抗体的基因组中的一个特定的蛋白质，在所在地可以用来代替。虽然幼虫翼光盘原位技术已经几年的蝴蝶，目前的协议进行了优化，为更大，更脆弱的蛹翅膀。
Protocol
第1天
- 准备了以下解决方案：
- 10X PBS
- 1X PBS
- 1X PBT
- DDH 2 Ø
- 添加0.1％，总体积的DEPC处理和动摇的解决方案大力。
- 高压灭菌。
- 4％多聚甲醛固定 - 用PBS用DEPC
- 蛋白酶K的解决方案 - 如果沉淀物存在，涡大力前删除等分
- 消化终止缓冲液
- 预杂交缓冲
- 50:50 PBT：预杂交缓冲
- 杂交缓冲液
- 解决方案应保持无RNase。使用已经出炉无论是玻璃制品（250 ° C，4小时）或一次性塑料。血清移液器是非常有用的解决方案
- 解剖从翅膀的时间上演蛹在PBS
- 移动的翅膀，直接固定在井24孔培养板在室温下的缓冲区
- 修正了2个小时的光碟
- 在PBT洗5 × 5分钟
- 蛋白酶K溶液中孵育3分钟的翅膀
- 停止在消化缓冲液冲洗2 ×
- 在PBT洗5 × 5分钟
- 洗2 × 5分钟，在50:50 PBT：PHB
- 1 × 10分钟洗净的PHB
- PHB至少1小时的孵育55 ° C。
- 热变性RNA探针（20 - 50ng每口井需要）（80 ° C为5分钟），并添加杂交缓冲液（每口井所需的100μL）
- 探头井孵育48小时，在55 ° C
第3天
- 洗净4 × 5分钟，55 ° C的PHB
- 在PHB的孵育过夜，55 ° C
第4天
- 准备了以下解决方案：
- 抗体块缓冲区
- 1个5分钟在50:50 PBT：PHB的洗净
- 在PBT洗4 × 5分钟
- 孵育1小时块缓冲区的翅膀在4 ° C
- 在1:2000稀释的抗地高辛抗体4℃过夜孵育翅膀° C
第5天
- 准备以下解决方案：
- 检测缓冲液
- 开发解决方案 - 光敏感（铝箔包装）
- 在室温下清洗3 × 5分钟，在PBT
- 洗净7 × 5分钟在PBT
- 冲洗翅膀两次检测缓冲液
- 制定在1毫升开发解决方案的翅膀 - 时间的发展，必须监测每次 - 发展的时代，可以改变，即使使用相同的探针和发展的解决方案 - 检查一般5-10分钟后，再增加间隔在一夜之间。板应在铝箔包裹，以防止光线照射时不检查样品。
- 发展终止缓冲液冲洗5次
- 摩的翅膀。
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Discussion
优化现有的协议
幼虫翼片原位杂交已成功采用PRECIS coenia蝴蝶光盘（卡罗尔等人1994;。键等，1999;。Weatherbee等1999年）。从卡罗尔实验室的要求后，幼虫翼染色法进行详细的书面协议，目前协议已经适应。我们所做的改变，以适应幼虫和蛹的右翼组织之间的差异。蛹hindwing解剖期间，peripodial膜应被删除，并且不包括在井。初步修复时间更长，在我们的协议，但已被删除后的修复步骤。我们发现，10倍稀释的蛋白酶K的解决方案，为脆弱的蛹翼组织，同时仍然允许成功探测渗透必要的。我们还发现，阻断的翅膀抗体染色前大大降低了背景，而增加在4抗体孵育过夜° C升高的信号强度。
应用
本协议的应用是多方面的。能够上一个发展中的蛹翼的候选基因的表达本地化的第一步将在2004年卷入一些在翼或翼发展格局中的职能作用的基因（马库斯等人。拉莫斯等2006）。如果已知在其他系统交互的几个基因共同表达的翅膀一起可能涉及更详细的基因网络，在指定新颖的机翼模式选项（蒙泰罗等2006）。蝴蝶翅膀图案演化DEVO相关EVO DEVO问题涉及的基因和基因网络的合作选项，新奇的演变，融合和并行性状的演变，进化的序列同源性和基因的过程提供了丰富的系统重复和子功能化都可以在一个综合的方式加以研究。此外，蝴蝶翼模式，发挥的作用在物种识别性选择，模仿，体温调节和捕食避免显示五花八门。了解这些模式的产生背后的遗传和发育的基础，以及有利于某些模式的生态因子，能够给我们带来一个全面了解的进化过程和发育系统实施这个过程中的偏见和约束。
为适应不同物种的优化准则
当本议定书适应不同物种的翅膀，主要关注的将是组织渗透到探头，同时维持组织的完整性。因此，固定和permeablization步骤进行优化。对于Bicyclus蛹的翅膀，我们已经发现，在室温下2小时修复新鲜煤灰缓冲区和一个温柔的蛋白酶K消化就足够了。组织可能是固定的长达12小时，在4 ° C如有必要，但有可能超过修复组织，这将减少信号，所以较短的固定时间是首选。这两种酶的浓度和消化的长度和温度应凭经验确定的每个组织。年龄的翅膀，也可能在消化的一个重要因素，因为旧的翅膀将有更详细的表皮结构和NaY需要一个较长的消化。重要的是要记住，蛋白酶K的准备工作，市面上的不规范一项具体活动，因此，可能还需要消化条件变化的地段时，要调整。透气性的组织，也可以增加孵育洗涤剂解决方案，例如，1％的Triton - X解决方案。这可能是前加入预杂交步骤。
另一个令人关注的问题将是优化探头的大小，一般的经验法则，被更大更好。鲍勃里德，已在所在地进行后期蛹翼在Heliconius，建议为目标的大小（个人通信）300个基点。较大的探头，这可能会增加信号的特异性，可水解进入细胞，以帮助他们进入。然而，在其他系统中，研究人员经常使用未经水解1 KB探头。在这里，我们用探针约300bp作为工作得很好。
riboprobes工作可以恐吓，不是用来处理RNA的实验室。我们发现这种技术是相当强大的，并包含几个步骤，最大限度地减少损失的探头，由于RNase活性。蛋白酶K消化，去除RNase污染和预杂交/杂交缓冲50％甲酰胺会抑制RNase活性（Chomczynski 1992年）。因此，我们鼓励人们使用riboprobes这增加了信号的特殊性和艰巨的，因为有些人可能认为不作为。
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Acknowledgments
我们感谢杰恩Selegue，玛格丽特霍林斯沃思，金莓果，亮Futahashi，Najmus萨哈尔牢哈，亚历山大Popadic，鲍勃里德，罗氏帮助排除本议定书的技术支持。我们也感谢威廉彼尔编辑电影的意见。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Mounting Medium |
References
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