चूहा sciatic तंत्रिका से Axoplasm अलगाव

Summary

हम वयस्क चूहे sciatic तंत्रिका तंत्रिका hypotonic मध्यम और fascicles ऊष्मायन के विच्छेदन माइलिन रिलीज और गैर - axonal संरचनाओं, शेष सामग्री अक्षतंतु समृद्ध निकासी के बाद lyse पर आधारित से axoplasm अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है.

Abstract

परिधीय तंत्रिका से शुद्ध axonal cytoplasm (axoplasm) के अलगाव कई जैविक प्रक्रियाओं के जैव रासायनिक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है. इस अनुच्छेद में, हम प्रदर्शन और वयस्क चूहे sciatic तंत्रिका निम्न चरणों का पालन पर आधारित से axoplasm अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन: (1) तंत्रिका fascicles और संयोजी ऊतक की जुदाई के विच्छेदन, (2) hypotonic मध्यम में तंत्रिका fascicles के छोटे क्षेत्रों की ऊष्मायन myelin की रिहाई और गैर - axonal संरचनाओं lyse, और (3) शेष सामग्री अक्षतंतु समृद्ध की निकासी. इस तैयारी के प्रोटिओमिक और जैव रासायनिक लक्षण वर्णन axonal घटकों के लिए एक संवर्धन के उच्च डिग्री पुष्टि की है.

Protocol

इस प्रोटोकॉल glial और संवहनी ऊतक संदूषण के न्यूनतम के साथ axoplasm अलगाव की अनुमति देता है. विधि एक 8-10 सप्ताह पुराने Wistar चूहे के अनुसार लगभग 70-100 μg कुल axoplasm प्रोटीन पैदावार.

1. Sciatic नसों काटना

1. सीओ ₂ ग्रीवा अव्यवस्था के बाद साँस लेना द्वारा दो चूहों euthanize. दिल की धड़कन की कमी के लिए छूकर शुरुआत विच्छेदन के लिए पहले से मौत की पुष्टि करें.
2. 70% इथेनॉल के साथ विच्छेदन क्षेत्र झाड़ू से साफ़ करना.
3. कट में त्वचा, अलग मांसपेशियों और sciatic तंत्रिका कैंची और संदंश हानिकारक रक्त वाहिकाओं के बिना सावधानी का उपयोग अलग. दोनों sciatic नसों (बारे में 1.5 सेमी प्रत्येक) और प्रत्येक जानवर से 500 μL पीबीएस 0.2X + inhibitors के साथ एक Eppendorf में सभी चार नसों इकट्ठा, बर्फ पर रखा काटना.
4. प्लास्टिक पीबीएस 0.2X + protease inhibitors के कम से कम 2 एमएल युक्त व्यंजन तंत्रिका क्षेत्रों स्थानांतरण.
5. द्विनेत्री गुंजाइश के तहत ठीक संदंश का उपयोग नसों से epineurium निकालें. Fascicles बहुत ध्यान से अलग है जब तक वे बादल बन और समाधान की सतह पर तैरने लगते हैं शुरू. इस कदम जब तक यह जल्दी और सही ढंग से किया जा सकता है (तंत्रिका प्रति 10 मिनट से अधिक नहीं लेने) अभ्यास किया जाना चाहिए.

2. ऊष्मायन, धुलाई, और Elution

1. स्थानांतरण पीबीएस 0.2X के 500 μL कमरे के तापमान पर 2 घंटा के लिए ऊष्मायन के लिए protease inhibitors युक्त के साथ एक ताजा Eppendorf ट्यूब fascicles अलग.
2. Eppendorf ट्यूब से Eppendorf ट्यूब fascicles हस्तांतरण और स्थानांतरण के बाद 5 मिनट के लिए मिलाते हुए एक ही बफर के 1 एमएल के साथ कम से कम 3 बार धोएं.
3. तरल पदार्थ की अधिक निकालने के लिए एक नया खाली Eppendorf ट्यूब में fascicles डाल दिया और फिर एक नई Eppendorf ट्यूब पीबीएस 1X के 300 μL आरटी पर 20-30 मिनट के लिए ऊष्मायन के लिए protease अवरोध करनेवाला युक्त के साथ fascicles हस्तांतरण.
4. 10,000 XG पर 4 बजे 10 मिनट अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
5. सतह पर तैरनेवाला और उपाय प्रोटीन एकाग्रता ले लो. यह आपके axoplasm तैयारी है.

3. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1. पश्चिमी धब्बा की तुलना axoplasm अलग नमूने के रूप में इस प्रोटोकॉल में दिखाया के साथ मैनुअल निचोड़ विधि द्वारा पृथक axoplasm albumin और GFAP के कम स्तर, रक्त में प्रोटीन और glial सेल contaminations का प्रतिनिधित्व नोट, क्रमशः. इसके विपरीत, axonal ट्यूबिलिन B3 इस तैयारी में समृद्ध है, axonal प्रोटीन का एक उच्च स्तर का संकेत है.

Discussion

बायोकेमिकल और प्रोटिओमिक विश्लेषण की पुष्टि की है कि इस प्रक्रिया सीरम और glial ^सेल संदूषण 3 को कम कर देता ^है के रूप में यांत्रिक 1 निचोड़ द्वारा पहले वर्णित axoplasm अलगाव के लिए तरीकों की तुलना में. हम इस axoplasm अलगाव प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है sciatic तंत्रिका चोट के बाद ² dynein आधारित प्रतिगामी संकेतन का पता लगाने, और वयस्क परिधीय तंत्रिका में अक्षतंतु - glia ⁴ बातचीत सहित कई अन्य प्रक्रियाओं के अन्वेषण में उपयोगिता है उम्मीद है .

Materials

Male Wistar rats (8-10 weeks old) PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml Eppendorfs for 1.5 ml Sterilized plastic dishes 35 mm Dissecting tools including: scissors and fine forceps Binocular and table light

Antibodies

Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).