Summary
우리는 myelin를 공개하고 나머지 축삭 - 풍부한 자료의 추출 다음 비 axonal 구조를 lyse에 hypotonic 매체 신경 fascicles과 부화 해부에 따라 성인 쥐의 좌골 신경에서 axoplasm 절연을위한 프로토콜을 보여줍니다.
Abstract
주변 신경에서 순수 axonal 세포질 (axoplasm)의 분리는 많은 생물 학적 과정의 생화 학적 연구를 위해 매우 중요합니다. 이 문서에서는, 우리는 입증하고 다음 단계에 따라 성인 쥐의 좌골 신경에서 axoplasm 고립에 대한 프로토콜을 설명 : 신경 fascicles 및 결합 조직의 분리 (1) 절개를, hypotonic 매체 신경 fascicles의 짧은 세그먼트 (2) 인큐베이션 myelin을 릴리스 및 비 axonal 구조를 lyse을하며, (3) 남아있는 축삭 - 풍부한 자료의 추출. 이 준비 Proteomic 및 생화 학적 특성은 axonal 구성 요소에 대한 농축 높은 학위를 확인했습니다.
Protocol
이 프로토콜은 glial 및 혈관 조직 오염의 최소화와 axoplasm 고립 수 있습니다. 방법은 하나의 80~10주 이전 위스타 랫 약 70-100 μg 총 axoplasm 단백질을 산출.
1. 좌골 신경을 해부하다
- 자궁 경부 전위 다음 CO 2 흡입하여 두 쥐를 안락사. 처음의 해부하기 전에 심장 박동의 부족에 대한 촉진에 의해 죽음을 확인합니다.
- 면봉 70 % 에탄올로 절개 지역.
- 피부, 별도의 근육을 잘라 손상 혈관 않고 신중하게 가위와 집게를 사용하여 좌골 신경을 분리. 모두 좌골 신경 (약 1.5 cm 각) 각각의 동물에서 500 μL PBS 0.2X + 억제제와 eppendorf의 네 명 모두 신경을 수집, 얼음에 보관 해부하다.
- PBS 0.2X + 프로 테아제 억제제의 최소한 2 ML를 포함하는 플라스틱 요리에 신경 세그먼트를 전송합니다.
- 쌍안경 현미경 미세 집게를 사용하여 신경의 epineurium를 제거합니다. 그들은 흐린가 될 때까지 아주 조심스럽게 fascicles를 분리 및 솔루션의 표면에 떠을 시작합니다. 그것이 (신경 회 이상 10 분 복용하지 않음) 신속하고 정확하게 수행할 수있을 때까지이 단계는 연습을해야합니다.
2. 부화, 세척 및 용출
- 전송 실온에서 2 시간을위한 인큐베이션에 대한 단백 분해 효소 억제제를 포함하는 PBS 0.2X 500 μL와 신선한 eppendorf 튜브에 fascicles 분리.
- eppendorf 튜브에서 eppendorf 튜브에 fascicles을 전송 전송 후 5 분 흔들어하여 동일한 버퍼 1 ML 최소한 3 번 씻으십시오.
- 유체 초과 제거하는 것은 새로운 빈 eppendorf 튜브에 fascicles를 넣고 다음 RT에서 20-30 분 배양을위한 테아제 억제제를 포함하는 PBS 1X 300 μL와 새로운 eppendorf 튜브에 fascicles을 전송하기만하면됩니다.
- 4 만 XG에서 10 분 원심 분리기 ° C.
- 뜨는 및 측정 단백질 농도를 가져가라. 이것은 axoplasm 준비입니다.
3. 대표 결과
그림 1. 이 프로토콜과 같이 절연 axoplasm 샘플과 설명서를 쥐어 짜기 방법으로 절연 서양 얼룩 비교 axoplasm. 각각 혈액 단백질과 glial 세포 contaminations를 대표하는 알부민 및 GFAP의 감소 수준을합니다. 대조적으로, axonal tubulin B3는 axonal 단백질의 높은 수준을 나타내는이 준비 풍부합니다.
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Discussion
생화학 및 proteomic 분석 기계 쥐어 짜기 1 axoplasm 절연 이전에 설명한 방법에 비해이 절차는 혈청과 glial 세포 오염 3 감소 것으로 확인되었습니다. 우리는 좌골 신경 손상이 후 dynein 기반 역행 신호를 탐험하고 축삭 - glia 상호 작용 4를 포함한 성인 말초 신경 여러 프로세스의 탐사에 유틸리티를 기대이 axoplasm 격리 프로토콜을 사용하고 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Materials
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Antibodies |
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Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively). |
References
- Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve. Neuron. 40, 1095-1104 (2003).
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