Summary
我々は、ミエリンを解放し、残りの軸索に富む材料の抽出に続いて、非軸索の構造を、溶解する低張培地で神経の束とインキュベーションの解剖に基づいて、成体ラットの坐骨神経からの軸索原形質分離のためのプロトコルを示す。
Abstract
末梢神経からの純粋な軸索の細胞質（軸索原形質）の分離には多くの生物学的過程の生化学的研究にとって重要です。この記事では、次の手順に基づいて、成体ラットの坐骨神経からの軸索原形質分離のためのプロトコルを示し、説明します。神経の束と結合組織の分離の（1）解剖、神経束の短いセグメントの（2）インキュベーション低張培地でミエリンを解放し、非軸索の構造を溶解すること、（3）残りの軸索に富む材料の抽出。この準備のプロテオミクスと生化学的特性は、軸索のコンポーネントのための濃縮度の高い認識しています。
Protocol
このプロトコルは、グリアや血管組織の汚染の最小化と軸索原形質分離が可能になります。メソッドは、単一の80〜10週齢のWistar系ラットあたり約70から100μgのトータル軸索原形質のタンパク質が得られます。
1。坐骨神経を解剖
- 頸椎脱臼が続くCO 2吸入による2匹のラットを安楽死させる。最初の切開の前にハートビートの欠如のために触診によって死を確認してください。
- 綿棒を70％エタノールで清エリア。
- 皮膚を切り取り、別の筋肉や血管を損傷することなく、慎重にハサミとピンセットを使って坐骨神経を分離。各動物の両方から坐骨神経を（約1.5cmごとに）摘出し、氷上に置き、500μLのPBS 0.2 × +阻害剤とエッペンドルフのすべての4つの神経を、集める。
- PBS 0.2 × +プロテアーゼ阻害剤の少なくとも2 mLを含むプラスチック製の皿に神経セグメントを転送する。
- 双眼鏡、スコープの下に微細な鉗子を用いて神経から神経上膜を取り除く。彼らが白濁するまで非常に慎重に束を分離し、液の表面に浮くし始める。それは（神経あたり10分以上を服用していない）を迅速かつ正確に実行できるまで、このステップは実施されるべきである。
2。インキュベーション、洗浄および溶出
- 転送は、室温で2時間インキュベーションするためのプロテアーゼ阻害剤を含むPBS 0.2 ×500μLの新鮮なエッペンドルフチューブに束を分離。
- エッペンドルフチューブからエッペンドルフチューブに束を転送し、転送後、5分間振とう同じバッファー1mLで少なくとも3回洗浄する。
- 流体の過剰な削除するには、新しい空のエッペンドルフチューブに束を配置し、室温で20〜30分間インキュベーションするためのプロテアーゼ阻害剤を含むPBS 1Xの300μLで新しいエッペンドルフチューブに束を転送する。
- 4℃で10,000 × gで10分間遠心分離℃を
- 上清を測定タンパク質濃度を取る。これは軸索原形質の準備です。
3。代表的な結果
図1。として、このプロトコルに示すように分離された軸索原形質のサンプルとマニュアルスクイーズ法により分離された軸索原形質を比較するウエスタンブロットは。それぞれ、血中蛋白とグリア細胞の汚染を表すアルブミンとGFAPのレベル低下を、注意してください。対照的に、軸索チューブリンb3は軸索タンパク質の高レベルを示す、この準備に富んでいる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
生化学的およびプロテオーム解析は、機械的なスクイーズ1による軸索原形質分離のために前述の方法に比べて、この手順では、血清およびグリア細胞のコンタミネーション3を減少させることを確認した。我々は、坐骨神経損傷2の後ダイニンベースの逆行性シグナリングを探求し、それが軸索-グリア相互作用4を含む成人の末梢神経の他の多くのプロセス、の探査の有用性を有することを期待するために、この軸索原形質分離のプロトコルを使用している。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Materials
|
|||
Antibodies |
|||
Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively). |
References
- Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve. Neuron. 40, 1095-1104 (2003).
- Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).
- Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. Axoplasm isolation from peripheral nerve. Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).
- Twiss, J. L., Fainzilber, M.
