Axoplasm Isolering från Rat ischiasnerven

Summary

Vi visar ett protokoll för axoplasm isolering från vuxna råttor ischiasnerven bygger på dissekering av nerv fascicles och inkubation i hypoton medel för att släppa myelin och Lyse icke-axonal strukturer, följt av extraktion av kvarvarande axon berikade material.

Abstract

Isolering av ren axonal cytoplasma (axoplasm) från perifer nerv är avgörande för biokemiska studier av många biologiska processer. I den här artikeln visar vi och beskriva ett protokoll för axoplasm isolering från vuxna råttor ischiasnerven bygger på följande steg: (1) dissekering av nerv fascicles och separation av bindväv, (2) inkubering av korta segment av nerven fascicles i hypoton medelstora att släppa myelin och Lyse icke-axonal strukturer, och (3) utvinning av kvarvarande axon berikade material. Proteomik och biokemisk karakterisering av detta preparat har bekräftat en hög grad av anrikning för axonal komponenter.

Protocol

Detta protokoll möjliggör axoplasm isolering med minimering av stödjeceller och kärlvävnad föroreningar. Metoden ger cirka 70-100 mikrogram totalt axoplasm protein per en 8-10 vecka gammal Wistar råtta.

1. Dissekera ischiasliknande Nerver

1. Euthanize två råttor av CO ₂ inandning följt av halsdislokation. Bekräfta döds av palperas för bristande hjärtslag innan du börjar dissekering.
2. Tvätta dissektion området med 70% etanol.
3. Skär huden, separata muskler och isolera ischiasnerven med sax och pincett försiktigt utan att skada blodkärl. Dissekera både ischias nerver (ca 1,5 cm vardera) från varje djur och samla in alla fyra nerverna i ett Eppendorf med 500 mikroliter PBS 0,2 X +-hämmare, som hålls på is.
4. Överför nerven segment till plastskålar som innehåller minst 2 mL PBS 0,2 X + proteashämmare.
5. Ta bort epineurium från nerver med fin pincett under kikare omfattning. Separera fascicles mycket noga tills de blir klart och börjar flyta på ytan av lösningen. Detta steg bör praktiseras tills den kan utföras snabbt och exakt (som inte fick mer än 10 minuter per nerv).

2. Inkubation, tvättning och Elution

1. Överföring separerade fascicles till ett nytt Eppendorf-rör med 500 mikroliter PBS 0,2 X som innehåller proteashämmare för inkubering för 2 tim i rumstemperatur.
2. Tvätta minst 3 gånger med 1 ml av samma buffert genom att överföra fascicles från Eppendorf-rör till Eppendorf-rör och skaka i 5 min efter överlåtelsen.
3. Att avlägsna överskott av vätska sätta fascicles in i en ny tom Eppendorf-rör och sedan överföra fascicles till en ny Eppendorf-rör med 300 mikroliter PBS 1X innehåller proteashämmare för inkubering i 20-30 min på RT.
4. Centrifugera 10 min vid 10000 xg vid 4 ° C.
5. Ta supernatanten och mäta protein koncentration. Detta är din axoplasm beredning.

3. Representativa resultat

Figur 1. Western blot jämföra axoplasm isolerats av den manuella pressa metoden med axoplasm isolerade prover som visas i detta protokoll. Notera sänkta nivåer av albumin och GFAP, representerande blodprotein och gliaceller föroreningar cell, respektive. Däremot är axonal tubulin b3 anrikas i denna beredning, vilket indikerar en hög nivå av axonal proteiner.

Discussion

Biokemisk och proteomik analyser har bekräftat att detta förfarande minskar serum och gliacellsmarkörer kontamination ³ jämfört med tidigare beskrivna metoder för axoplasm isolering genom mekanisk klämma ^1. Vi har använt denna axoplasm isolering protokoll att utforska dynein-baserade retrograd signalering efter ischiasnerven skada ^2, och förväntar sig att ha nytta i utforskandet av många andra processer i vuxen perifer nerv, inklusive axon-Glia interaktioner ^4.

Materials

Male Wistar rats (8-10 weeks old) PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml Eppendorfs for 1.5 ml Sterilized plastic dishes 35 mm Dissecting tools including: scissors and fine forceps Binocular and table light

Antibodies

Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).