جبلة المحوار من عزل العصب الوركي الجرذ

Summary

نظهر بروتوكول للعزلة جبلة المحوار من العصب الوركي الجرذان الكبار على أساس تشريح الأعصاب وكراسات الحضانة في المتوسط ​​للإفراج ناقص التوتر وليز الميلين غير محواري الهياكل ، تليها استخراج المواد محوار التخصيب المتبقية.

Abstract

بمعزل عن السيتوبلازم محواري النقي (جبلة المحوار) من الأعصاب الطرفية أمر حاسم للدراسات الحيوية في العديد من العمليات البيولوجية. في هذه المقالة ، علينا أن نظهر ووصف بروتوكول للعزلة جبلة المحوار من العصب الوركي الجرذان الكبار على أساس الخطوات التالية : (1) تشريح الأعصاب والكراسات فصل النسيج الضام ، (2) حضانة شرائح قصيرة من الكراسات في العصب المتوسط ​​ناقص التوتر الافراج الميلين وليز غير محواري الهياكل ، و (3) استخراج المواد محوار التخصيب المتبقية. أكدت توصيف البروتين والبيوكيميائية هذا المستحضر على درجة عالية من التخصيب لمكونات المحاور.

Protocol

هذا البروتوكول يسمح العزلة جبلة المحوار مع التقليل من تلوث الأنسجة والأوعية الدموية الدبقية. الأسلوب غلة حوالي 70-100 ميكروغرام جبلة المحوار البروتين الكلي الواحد الفئران الأسبوع 80-10 يستار القديمة.

1. تشريح الأعصاب الوركي

1. الموت ببطء two الفئران عن طريق استنشاق أول أكسيد الكربون ₂ تليها خلع عنق الرحم. تأكيد الموت لعدم وجود تحسس نبض القلب قبل بداية تشريح.
2. المسحة مجال التشريح مع الايثانول 70 ٪.
3. قطع الجلد والعضلات منفصلة وعزل العصب الوركي باستخدام مقص وملقط بعناية دون الأوعية الدموية المدمرة. تشريح الأعصاب كلا الوركي (حوالي 1.5 سم لكل منهما) من كل حيوان ، وجمع كل الأعصاب الأربع في إيبندورف مع 500 ميكرولتر مثبطات PBS + 0.2X ، حافظ على الجليد.
4. نقل القطع إلى العصب الصحون البلاستيكية التي تحتوي على ما لا يقل عن 2 مل من 0.2X مثبطات الأنزيم البروتيني PBS +.
5. إزالة غلاف من الأعصاب باستخدام الملقط غرامة بموجب نطاق مجهر. فصل كراسات بعناية فائقة حتى يصبح غائما وبداية لتطفو على السطح من الحل. يجب أن تمارس هذه الخطوة حتى يمكن إجراء ذلك بسرعة وبدقة (وليس مع أكثر من 10 دقيقة في العصب).

2. الحضانة ، وشطف الغسيل

1. نقل فصل كراسات لأنبوب إيبندورف الطازجة مع 500 ميكرولتر من 0.2X PBS تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني للحضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
2. غسل ما لا يقل عن 3 مرات مع 1 مل من المخزن نفسه عن طريق نقل كراسات إيبندورف من أنبوب إلى أنبوب إيبندورف وتهتز لمدة 5 دقائق بعد نقلها.
3. لإزالة الفائض من السوائل وضعت في أنبوب كراسات إيبندورف فارغة جديدة ومن ثم نقل إلى كراسات أنبوب إيبندورف جديدة مع 300 ميكرولتر من 1X PBS التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني للحضانة لمدة 20-30 دقيقة في RT.
4. أجهزة الطرد المركزي في 10 دقيقة 10000 XG في 4 درجات مئوية.
5. اتخاذ طاف وقياس تركيز البروتين. هذا هو الإعداد الخاص جبلة المحوار.

3. ممثل النتائج

الشكل 1. جبلة المحوار الغربية لطخة مقارنة المعزولة بسبب أسلوب الضغط اليدوي مع عينات جبلة المحوار معزولة كما هو مبين في هذا البروتوكول. لاحظ انخفاض مستويات الزلال وGFAP ، وهو ما يمثل بروتين الدم والخلايا الدبقية التلوث ، على التوالي. في المقابل ، هو المخصب محواري B3 تويولين في هذا التحضير ، مما يدل على مستوى عال من البروتينات محواري.

Discussion

وقد أكدت التحاليل البيوكيميائية والبروتين أن هذا الإجراء يقلل من تلوث الدم والخلايا الدبقية ³ بالمقارنة مع الأساليب المذكورة سابقا لعزل جبلة المحوار بواسطة الضغط الميكانيكي ^1. وقد استخدمنا هذا البروتوكول العزلة جبلة المحوار لاستكشاف داينين ​​المستندة إلى إشارات إلى الوراء بعد إصابة العصب الوركي ² ، وتتوقع أن تكون ذات منفعة في استكشاف عمليات أخرى كثيرة في الأعصاب الطرفية الكبار ، بما في ذلك محور عصبي - الدبقية التفاعلات ^4.

Materials

Male Wistar rats (8-10 weeks old) PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml Eppendorfs for 1.5 ml Sterilized plastic dishes 35 mm Dissecting tools including: scissors and fine forceps Binocular and table light

Antibodies

Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).