Axoplasm Isolatie van Rat heupzenuw

Summary

Demonstreren we een protocol voor axoplasm isolatie van volwassen ratten heupzenuw op basis van dissectie van de zenuw bundels en incubatie in hypotone medium om myeline release en lyseren niet-axonale structuren, gevolgd door extractie van de resterende axon-verrijkt materiaal.

Abstract

Isolatie van pure axonale cytoplasma (axoplasm) van perifere zenuwen is van cruciaal belang zijn voor biochemisch onderzoek van de vele biologische processen. In dit artikel tonen we en beschrijven een protocol voor axoplasm isolatie van volwassen ratten heupzenuw op basis van de volgende stappen: (1) dissectie van de zenuw bundels en de scheiding van bindweefsel, (2) incubatie van korte segmenten van de zenuw bundels in hypotone medium aan myeline release en lyseren niet-axonale structuren, en (3) extractie van de resterende axon-verrijkt materiaal. Proteomics en biochemische karakterisering van deze voorbereiding heeft bevestigd dat een hoge mate van verrijking voor axonale componenten.

Protocol

Dit protocol maakt axoplasm isolatie met een minimalisering van gliale en vasculaire besmetting van de weefsels. De methode levert ongeveer 70 tot 100 ug totaal eiwit per axoplasm een ​​8-10 weken oud Wistar rat.

1. Ontleden bil Zenuwen

1. Euthanaseren twee ratten door CO ₂ inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie. Bevestig dood door palperen bij gebrek aan hartslag voor het begin van dissectie.
2. Uitstrijkje van de dissectie gebied met 70% ethanol.
3. Snijd de huid, de spieren los en te isoleren heupzenuw met een schaar en pincet voorzichtig zonder beschadiging van bloedvaten. Ontleden zowel sciatic zenuwen (ongeveer 1,5 cm per stuk) van elk dier en alle vier de zenuwen in een eppendorf met 500 pi PBS + 0,2 x-remmers te verzamelen, bleef op het ijs.
4. Breng de zenuw segmenten van kunststof borden met ten minste 2 ml PBS + 0,2 x protease-remmers.
5. Haal de epineurium van de zenuwen met behulp van fijne pincet onder de binoculair scope. Scheid de bundels zeer zorgvuldig totdat ze bewolkt en begint te zweven op het oppervlak van de oplossing. Deze stap moet geoefend worden totdat het kan snel en nauwkeurig worden uitgevoerd (niet het nemen van meer dan 10 minuten per zenuw).

2. Incubatie, Wassen en elutie

1. Overdracht gescheiden bundels een nieuwe eppendorfbuisje met 500 pi PBS 0,2 x met protease remmers voor incubatie gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
2. Was minstens 3 keer met 1 ml van dezelfde buffer door de overdracht van de bundels van eppendorfbuisje tot eppendorfbuisje en schudden gedurende 5 minuten na de overdracht.
3. Voor het verwijderen van overmaat aan vocht de bundels in een nieuw leeg eppendorfbuisje en breng de bundels aan een nieuwe eppendorfbuisje met 300 pi PBS 1X met protease-remmer voor incubatie gedurende 20-30 min bij RT.
4. Centrifugeer 10 min bij 10.000 xg bij 4 ° C.
5. Neem het supernatant en meet eiwit concentratie. Dit is uw axoplasm voorbereiding.

3. Representatieve resultaten

Figuur 1. Western blot vergelijken axoplasm geïsoleerd door de handmatige methode knijpen met geïsoleerde axoplasm monsters zoals in dit protocol. Let op de lagere niveaus van albumine en GFAP, die het bloed eiwit-en gliale cel besmettingen, respectievelijk. In tegenstelling, is axonale tubuline b3 verrijkt met dit preparaat, wat wijst op een hoge mate van axonale eiwitten.

Discussion

Biochemische en proteomics analyses hebben bevestigd dat deze procedure serum en gliale cel besmetting ³ vermindert in vergelijking met de eerder beschreven methoden voor het axoplasm isolatie door mechanisch persen ^1. We hebben gebruik gemaakt van deze axoplasm isolatie protocol om dyneine op basis van retrograde signalering verkennen na heupzenuw verwonding ^2, en het nut te hebben in de exploratie van de vele andere processen in de volwasseneneducatie perifere zenuwen, met inbegrip van axon-glia interacties ⁴ verwachten.

Materials

Male Wistar rats (8-10 weeks old) PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml Eppendorfs for 1.5 ml Sterilized plastic dishes 35 mm Dissecting tools including: scissors and fine forceps Binocular and table light

Antibodies

Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).