Аксоплазме Изоляция от седалищного нерва крысы

Summary

Мы демонстрируем протокол для аксоплазме изоляции от взрослой крысы седалищного нерва на основе рассечение нервных пучков и инкубации в гипотонической среде, чтобы освободить миелина и лизировать не-аксонального структур с последующим извлечением оставшейся аксон обогащенного материала.

Abstract

Выделение чистой аксонального цитоплазмы (аксоплазме) из периферических нервов имеет решающее значение для биохимических исследований многих биологических процессов. В этой статье мы покажем и описать протокол для аксоплазме изоляции от взрослой крысы седалищного нерва основано на следующие этапы: (1) рассечение нервных пучков и разделения соединительной ткани; (2) инкубация коротких сегментов нервных пучков в гипотонической среде освободить миелина и лизировать не-аксонального структур, а также (3) извлечение из оставшихся аксон обогащенного материала. Протеомных и биохимические характеристики этого препарата подтвердили высокую степень обогащения аксонального компонентов.

Protocol

Этот протокол позволяет аксоплазме изоляция с минимизацией глиальных и сосудистых тканей загрязнения. Метод дает примерно 70-100 мкг общего белка аксоплазме на одну неделю 8-10 старых крыс линии Вистар.

1. Рассеките седалищного нерва

1. Усыпить двух крыс СО ₂ ингаляции следуют шейный дислокации. Подтверждение смерти пальпации из-за отсутствия сердцебиения до начала вскрытия.
2. Тампон рассечение области с 70% этанола.
3. Сокращение кожи, отдельные мышцы и изолировать седалищного нерва с помощью ножниц и пинцета осторожно, не повреждая кровеносные сосуды. Рассеките и седалищного нервов (около 1,5 см каждый) от каждого животного и собрать все четыре нервы в Эппендорф с 500 мкл PBS 0,2 x + ингибиторы, держится на льду.
4. Передача нервных сегментов пластической блюд, содержащих не менее 2 мл ФСБ 0,2 x + ингибиторы протеазы.
5. Удалить эпиневрий от нервов с использованием тонких щипцов под бинокулярным области. Отдельные пучки очень осторожно, пока они не становятся мутными и начинают плавать на поверхности раствора. Этот шаг следует практиковать, пока она может быть выполнена быстро и точно (не считая более чем на 10 мин на нерв).

2. Инкубационный, стиральная и Элюирование

1. Передача разделенные пучки на новую пробирку Эппендорф с 500 мкл PBS 0,2 x содержащие ингибиторы протеазы для инкубации в течение 2 часов при комнатной температуре.
2. Мойте по крайней мере 3 раза 1 мл того же буфера путем перечисления пучки из пробирки Эппендорф в пробирку Эппендорфа и встряхивания в течение 5 минут после передачи.
3. Чтобы удалить избыток жидкости положить пучки в новую пустую пробирку Эппендорфа, а затем передать пучки в новую пробирку Эппендорф с 300 мкл PBS 1X содержащие ингибитор протеазы для инкубации в течение 20-30 минут при комнатной температуре.
4. Центрифуга 10 мин при 10 000 мкг при 4 ° C.
5. Возьмите супернатант и концентрации мера белка. Это ваша аксоплазме подготовки.

3. Представитель Результаты

Рисунок 1. Иммуноблоттинга сравнения аксоплазме изолированы ручной метод сжатия с аксоплазме образцов изолированных, как показано в этом протоколе. Обратите внимание, снижение уровня альбумина и GFAP, представляющих белков крови и глиальных загрязнений ячейка, соответственно. В противоположность этому, аксонального тубулина b3 обогащается в этом препарате, что указывает на высокий уровень аксонального белков.

Discussion

Биохимические и протеомных анализов подтвердили, что эта процедура сокращает сыворотку и глиальных клеток загрязнения ³ по сравнению с ранее описанных методов аксоплазме изоляции механического сжатия ^1. Мы использовали этот протокол аксоплазме изоляции для изучения динеин основе ретроградной сигнализации после седалищного нерва ^2, и ожидать, что она есть полезность в исследование многих других процессов у взрослых периферических нервов, в том числе аксон-глии взаимодействия ^4.

Materials

Male Wistar rats (8-10 weeks old) PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml Eppendorfs for 1.5 ml Sterilized plastic dishes 35 mm Dissecting tools including: scissors and fine forceps Binocular and table light

Antibodies

Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).