Sıçan Siyatik Sinir Axoplasm İzolasyon

Summary

Biz yetişkin sıçan siyatik sinir miyelin bırakın ve kalan akson zenginleştirilmiş malzeme çıkarılması takip olmayan aksonal yapıları, lyse hipotonik orta sinir fasiküller ve kuluçka diseksiyonu dayalı axoplasm izolasyonu için bir protokol göstermektedir.

Abstract

Periferik sinir saf aksonal sitoplazma (axoplasm) izolasyonu birçok biyolojik süreçlerin biyokimyasal çalışmalar için çok önemlidir. Bu makalede, biz göstermek ve yetişkin sıçan siyatik sinir aşağıdaki adımları dayalı axoplasm izolasyonu için bir protokol tarif: (1) sinir fasiküller ve bağ dokusu ayrılması diseksiyon, hipotonik ortamda sinir fasiküller kısa kesimleri (2) inkübasyon miyelin olmayan aksonal yapılar bırakın ve lyse; ve (3) kalan akson zenginleştirilmiş malzeme çıkarma. Bu hazırlık Proteomik ve biyokimyasal karakterizasyonu aksonal bileşenleri zenginleştirmek için yüksek derecede onaylamıştır.

Protocol

Bu protokol, glial ve vasküler doku kontaminasyonu en aza indirilmesi ile axoplasm izolasyon sağlar. Bu yöntem, bir 8-10 haftalık Wistar sıçan başına yaklaşık 70-100 mg toplam axoplasm protein verir.

1. Siyatik Sinir teşrih

1. CO ₂ inhalasyon servikal dislokasyon iki sıçan Euthanize. Kalp atışı olmadığı için başından diseksiyonu önce palpe ölüm onaylayın.
2. Swab% 70 etanol ile diseksiyon alanı.
3. Cilt, ayrı kaslar kesin ve siyatik sinir, zararlı kan damarları olmadan makas ve forseps kullanarak dikkatli bir şekilde izole. Hem siyatik sinirleri teşrih (yaklaşık 1,5 cm), her hayvan ve 500 mcL PBS 0,2 X + inhibitörleri ile bir Eppendorf dört sinirler toplamak, buz üzerinde tutulmalıdır.
4. En az 2 mL PBS 0,2 X + proteaz inhibitörleri içeren plastik tabaklar sinir segmentleri aktarın.
5. Binoküler kapsamında ince forseps kullanarak sinirler epineurium çıkarın. Bulutlu hale gelene kadar çok fasiküller dikkatle ayırın ve çözüm yüzeyinde yüzen başlar. Bu adım (10 dakika başına daha fazla sinir almayan) hızlı ve doğru bir şekilde yapılabilir kadar uygulanmalıdır.

2. Kuluçka, Çamaşır ve Elüsyon

1. Transfer oda sıcaklığında 2 saat inkübasyon proteaz inhibitörleri içeren PBS 0,2 X 500 mcL ile taze bir Eppendorf tüp fasiküller ayrılmış.
2. 1 ml Eppendorf tüp Eppendorf tüp fasiküller transferi ve transfer edildikten sonra 5 dakika sallayarak aynı tampon ile en az 3 kez yıkayın.
3. Fasiküller sıvı aşırı kaldırmak için yeni ve boş bir Eppendorf tüp içine koymak ve sonra oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübasyon için proteaz inhibitörü içeren PBS 1X 300 mcL ile yeni bir Eppendorf tüpüne fasiküller transfer.
4. 10,000 xg'de 10 dakika santrifüjleyin 4 ° C
5. Süpernatantı ve ölçü protein konsantrasyonu atın. Bu sizin axoplasm hazırlık.

3. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1. Bu protokol gösterildiği gibi izole axoplasm örnekleri ile el sıkma yöntemi ile izole edilen Western Blot karşılaştırarak axoplasm. Sırasıyla, kan protein ve glial hücre Bulaşmayı temsil albümin ve GFAP düzeylerinde azalma, dikkat edin. Buna karşılık, aksonal tubulin b3 aksonal proteinlerin yüksek seviyesini gösteren, bu hazırlık zenginleştirilmiştir.

Discussion

Biyokimyasal ve proteomik analiz, mekanik ^sıkmak 1 axoplasm izolasyonu için daha önce açıklanan yöntemleri ile karşılaştırıldığında bu yordamı serum ve glial hücre ^{kontaminasyonu} 3 azalttığını teyit etmiştir . Biz, sonra dynein tabanlı retrograd sinyalizasyon siyatik sinir ^yaralanması 2 keşfetmek ve erişkin periferik sinir akson-glia etkileşimler de dahil olmak ^üzere 4 arama, pek çok diğer işlemler yardımcı olmasını bekliyoruz bu axoplasm izolasyon protokolü kullandık.

Materials

Male Wistar rats (8-10 weeks old) PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml Eppendorfs for 1.5 ml Sterilized plastic dishes 35 mm Dissecting tools including: scissors and fine forceps Binocular and table light

Antibodies

Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).