Summary
Para o desenvolvimento de interferência de RNA (RNAi) baseado em terapias, uma nova estratégia foi desenvolvida, transkingdom RNAi (tkRNAi). Esta tecnologia utiliza bactérias não-patogênicas de produzir e entregar terapêutica curto hairpin RNA (shRNA) em células-alvo. Aqui, tkRNAi foi aplicado com sucesso para a reversão de multirresistência clássica ABCB1 mediada (MDR) de células cancerosas.
Abstract
Interferência de RNA (RNAi) representa um mecanismo de alto eficaz para inibição específica de expressão de mRNA. Além de seu potencial como uma ferramenta poderosa de laboratório, a via RNAi parece ser promissor para uso terapêutico. Para o desenvolvimento de interferência de RNA (RNAi) baseado em terapias, a entrega de RNAi-agentes mediadores de células-alvo é um dos grandes obstáculos. A nova estratégia para superar este obstáculo é transkingdom RNAi (tk RNAi). Esta tecnologia utiliza bactérias não-patogênicas, por exemplo, Escherichia coli, para produzir e entregar terapêutica curto hairpin RNA (shRNA) em células-alvo para induzir RNAi. A primeira geração tk RNAi-mediadora vector TRIP, contém o bacteriófago T7 promoter de regulação da expressão de um shRNA terapêutico de interesse. Além disso, TRIP tem o locus de Inv Yersinia pseudotuberculosis, que codifica invasin, que permite que as bactérias naturais não-invasivo para entrar β1 positiva de integrina células de mamíferos eo gene HlyA de Listeria monocytogenes, que produz listeriolisina O. Esta enzima permite que o shRNA terapêuticas para escapar entrada vesículas no citoplasma da célula-alvo. Constrói TRIP são introduzidos em um competente coli cepa não-patogênica coli, que codifica T7 RNA polimerase necessário para a síntese T7 promoter-driven de shRNAs. A molécula-alvo bem caracterizado de câncer associados para diferentes estratégias RNAi é ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Esta ABC-transportador atua como uma bomba de extrusão de drogas e media o "clássico" resistência a múltiplas drogas ABCB1 mediada (MDR) fenótipo de células de câncer humano, que é caracterizado por um padrão específico de resistência cruzada. ABCB1 expressando diferentes células de câncer de MDR foram tratados com anti-ABCB1 expressão shRNA vector rolamento E. coli. Este procedimento resultou na ativação das vias RNAi nas células do câncer e de um regulamento considerável para baixo do mRNA codificação ABCB1, bem como a bomba de extrusão correspondente drogas. Assim, a acumulação de drogas foi reforçada no pristine células resistentes a drogas câncer eo fenótipo MDR foi revertida. Por meio deste modelo os dados fornecem a prova de conceito que tk RNAi é adequado para a modulação de câncer de fatores associados, como por exemplo ABCB1, em células de câncer humano.
Protocol
1) Entrega bacteriana da shRNAs
- Antes de iniciar com a cultura bacteriana, um tem que se preparar LB médio e LB-ágar.
- Para o LB médio pesar extrato de levedura (0,5% w / v), Bacto triptona (1,0% w / v) e NaCl (0,6% w / v) e diluir estes componentes em água bidest. As soluções preparadas têm que ser esterilizados em autoclave e são, então, pronto para uso.
- Para LB-agar agar Bacto placas (1,5% w / v) tem de ser adicionado à LB médio anteriores à esterilização.
- Aquecer LB-ágar no microondas até que o LB-ágar esteja completamente dissolvido. Deixe a solução esfriar até que a garrafa pode ser tocado facilmente sem se queimar. Adicionar canamicina (100 mg / ml) para a seleção de clones positivos em outras etapas.
- Prepare LB-ágar placas em um banco de fluxo laminar (condições estéreis) pipetando 20 ml da solução de LB-ágar em 10 cm de Petri-pratos. Deixe arrefecer as placas até que o líquido tornou-se sólido. As placas estão agora prontos para usar e pode ser armazenado a 4 ° C.
- Vetores shRNA codificação expressão são transformados em E. competente ceq221 coli por choque térmico usando o procedimento de CaCl 2.
- A placa de bactérias transformadas em LB-ágar placas contendo 100 mg / ml de canamicina, feche a tampa, selar as placas com parafilme e cultivar de cabeça para baixo a 37 ° C durante a noite.
- Inocular culturas bacterianas com mini-clones positivos escolhendo colônias crescidas com uma picareta do dente. Transferir o palito em 7,0 ml de LB fresco médio, contendo 100 mg / ml kanamicina e cultivar a 37 ° C durante a noite em um shaker a 200 rpm.
- Inocular 100 ml de LB fresco médio, contendo 100 mg / ml kanamicina 1:100 com a cultura ao longo da noite em um mini-1 frasco Erlenmeyer l, e incubar a 37 ° C durante a noite em um shaker a 200 rpm.
- Semente de 25 x 10 4 (número de células inoculadas depende da velocidade do crescimento das células da linha celular de acordo; confluência deve ser 70-80% ~ 24 horas após a semeadura) células de carcinoma gástrico (EPG85-257RDB) por poço em 6 - pratos bem e incubar estes em 37 ° C, em um CO 2, 5% de água atmosfera saturada de vapor durante a noite.
- Anterior à infecção de células cancerosas, ao longo culturas noite de tk RNAi vector contendo E. coli são medidos em um fotômetro para determinar a OD 600. Diluir a solução de bactérias até uma densidade óptica de 0,5 é atingido (OD 600 = 0,5 é igual a 1,6 x 10 8 células bacterianas / ml).
- Substituir o FCS contendo meio de cultura de células do carcinoma de células contra FCS meio livre 30 min anterior para bacterianas co-incubação.
- Lavar as bactérias duas vezes com 1 x PBS, e diluir em soro livre de Leibovitz L-15 médio.
- Adicionar bactérias diluído para as células cancerosas na desejado MOI (multiplicidade de infecção = número de células bacterianas por célula de câncer) e co-incubação de bactérias e células de câncer por 2 horas a 37 ° C.
- Após 2 horas de células co-incubação de câncer foram lavadas duas vezes com PBS 1x x e uma vez com o soro contendo Leibovitz L-15 meio suplementado com 100 u / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / ml, 2,5 mg / ml anfotericina, 150 mg / ml de gentamicina, e 100 mg / ml de canamicina.
- Continuar a cultivar as células cancerosas a 37 ° C, em um CO 2, 5% de água atmosfera de vapor saturado.
- Os efeitos do tratamento de bactérias pode ser visualizada por microscopia fluorescente, medido pelo quantitativo em tempo real RT PCR em nível de mRNA, e pela análise de western blot em nível de proteína, e mostra com ensaios funcionais como FACS, análise e ensaios de proliferação celular. (Se queria, estes procedimentos podem ser descritos em detalhe).
2) Resultados Representante
Se o protocolo for realizado corretamente, os resultados devem ser comparáveis aos mostrado abaixo.
Microscopia de fluorescência
A Figura 1 mostra uma célula de carcinoma gástrico humano três horas após o tratamento bacteriana (a) em comparação com uma célula não tratada (b). Ao redor do núcleo da célula tratada, as bactérias podem ser detectadas.
Figura 1: microscopia fluorescente de células de carcinoma gástrico Humanos após o tratamento de bactérias (1:500) e uma célula de carcinoma gástrico humano sem tratamento como controle, DAPI-coloração, DAPI bandpass filter (Λem = 640 nm), objetiva de 40x.
Quantitativa em tempo real RT PCR
Na figura 2 um regulamento para baixo de MDR1 mRNA de cerca de 70% (feixe de preto) pode ser visto após o tratamento com a bactéria terapêutico. Células dos pais servem como um controle positivo, devido à falta de MDR1 superexpressão. A linhagem celular 257RDB p170 contendo um plasmídeo expressando anti-MDR1 shRNAs s tomado como comparação direta da tecnologia de RNAi para R transkingdom outrosNAi silenciar estratégias. A linhagem de células resistentes tratadas EPG85-257RDB superexpressão MDR1, a linha de celular mesmo tratados com bactérias sem o plasmídeo shRNA expressar, e esta linhagem de células tratadas com bactérias terapêutica carregando um plasmídeo expressando anti-MRP2 shRNAs foram tomados como controles positivos.
Figura 2: quantitativa em tempo real RT PCR a expressão do mRNA MDR1 após o tratamento com E. terapêutica ceq221 coli expressando anti-MDR1 shRNAs (MOI 1: 500). Normalização foi realizada através do aldolase gene housekeeping. A relação MDR1/aldolase de células não tratadas da linha celular EPG85-257RDB foram criados 100%. P-valores foram calculados usando o teste t de Student (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Ocidental blot
Figura 3 revela que a MDR1 regulação também ocorreu no nível de proteína após o tratamento de bactérias. Ela mostra a falta de expressão da MDR1 linhagem de células de drogas sensíveis parental (EPG85-257p), a expressão da MDR1 não tratada linhagem de células resistentes aos medicamentos (EPG85-257RDB) ea expressão MDR1 da amostra tratada. A regulamentação clara para baixo de MDR1 das células tratadas com bactérias pode ser observada. 
Figura 3: análise de Western blot MDR1 níveis de expressão do tratado de drogas sensíveis EPG85-257p, a não tratada resistentes a drogas EPG-257RDB, e de EPG85-257RDB após co-incubação com E.. coli ceq221 + p43 MDR1. Principal Ab C219 1:100, e anti-actina 1:5 000, secundário Ab anti-mouse 1:10 000.
Ensaio de citotoxicidade
Análise funcional como o ensaio de citotoxicidade mostrado na figura 4 também são indicadores para o funcionamento do RNAi transkingdom. A linhagem de células parentais e da linha de célula que contém um shRNA anit-MDR1 expressar plasmídeo não mostram qualquer resistência à daunorrubicina. A linhagem de células resistentes EPG85-257RDB e dois controles ainda não mostram mudanças significativas na resistência em comparação com a amostra tratada com anti-bactérias MDR1 shRNA expressando onde a resistência à daunorrubicina pode ser revertido em cerca de 90%.
Figura 4: Ensaio de Citotoxicidade. Drogas específicas IC50-valores determinados por um ensaio de citotoxicidade para a sobrevivência da célula. P-valores foram calculados usando o teste t de Student (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Antraciclina ensaio de acumulação
De acordo com a baixa resistência de amostras de bactérias tratada (figura 4), o acúmulo de células antraciclina anti-MDR1 shRNA tratada é aumentada em cerca de 90%, como mostrado na figura 5. A linhagem de células parentais e as linha celular 257RDB p170 mostram uma forte acumulação daunorrubicina até 100%. A variante resistente mostra raramente qualquer acumulação. Células tratadas com anti-bactérias MDR1 shRNA expressar mostram um aumento de acumulação anthracyline de 90%.
Figura 5: ensaio de antraciclina acumulação. Antraciclina acúmulo de células de carcinoma seis dias após o tratamento de bactérias medida por citometria de fluxo. P-valores foram calculados usando o teste t de Student (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O número de células semeadas para a infecção e os MOI correspondentes utilizados, dependem criticamente as linhas de células sob observação e sua velocidade de crescimento. Para encontrar o número de células ideal para a semeadura, a pré-experimentos para determinar a velocidade de crescimento são fortemente recomendados. Além disso, MOIS diferentes devem ser testados, devido à limitada estender-se que as células podem suportar a invasão bacteriana sem morrer de stress. O ponto ótimo de tempo em que a regulação para baixo do gene sob observação pode variar. Recomenda-se realizar experimentos durante um certo período de tempo para encontrar as condições ideais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Trabalho foi financiado por bolsa nenhuma. 01GU0615 do "Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | |
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | |
| Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
References
- Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).
- Lage, H. MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance. Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).
- Lage, H. An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem. Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).
- Lage, H. Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers. Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).
- Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing. Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).
- Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi. FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).
- Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference. Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).
- Stein, U. Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA. Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).
- Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals. Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).
