Summary
RNA干扰(RNAi)技术为基础的疗法的发展,一种新型的战略发展,transkingdom RNA干扰(tkRNAi)。该技术使用非致病性细菌产生并传递到靶细胞治疗短发夹RNA(shRNA)。在这里,tkRNAi成功地应用于古典ABCB1介导的多药耐药(MDR)的癌细胞逆转。
Abstract
RNA干扰(RNAi)代表一个特定的mRNA表达抑制的高效机制。除了其作为一个功能强大的实验室工具的潜力,RNAi途径似乎是有希望的治疗利用。对于RNA干扰(RNAi)技术为基础的治疗,交付的发展RNA干扰调解剂对靶细胞的主要障碍之一。一种新的策略,以克服这一障碍是transkingdom RNA干扰(RNAi的TK)。这种技术采用非致病性细菌,如大肠杆菌 ,产生并传递到靶细胞治疗短发夹RNA(shRNA)诱导的RNAi。第一代TK的RNAi介导载体,跳闸,含有噬菌体T7启动子表达调控治疗的shRNA利益。此外,行程由耶尔森氏菌pseudotuberculosis发票编码invasin的轨迹,允许自然的非侵入性细菌进入β1整合素阳性哺乳动物细胞和单核细胞增生李斯特菌HlyA基因,产生listeriolysin O.这种酶可以使治疗的shRNA摆脱项囊泡内的靶细胞的细胞质中。 TRIP结构是一个称职的非致病性大肠埃希氏菌菌株,编码T7 RNA聚合酶对T7启动子驱动的shRNA的合成所必需的引入。一个良好的特点与癌症相关的,针对不同的RNAi战略目标分子是ABCB1(MDR1/P-glycoprotein,MDR1/P-gp)。这ABC转运行为,作为药物挤压泵和调解“经典”ABCB1 -介导的多药耐药(MDR)的特点是由一个特定的交叉耐药模式的人类癌症细胞的表型。不同的ABCB1表达MDR肿瘤细胞治疗与反ABCB1 shRNA表达载体轴承 E. 大肠杆菌 。此过程导致癌细胞内的RNAi途径激活一个相当大的下调ABCB1编码的mRNA以及相应的药物挤出泵的。因此,增强药物蓄积在质朴的耐药癌细胞MDR表型逆转。通过这种模式,数据提供的证据的概念,TK RNAi是适用于癌症相关的因素,如ABCB1在人类癌细胞中,调制。
Protocol
1)细菌的shRNA的交付
- 与细菌培养开始之前,人们已经准备LB培养基和LB琼脂。
- LB培养基掂量出酵母提取物(0.5%W / V),细菌用胰蛋白胨(1.0%W / V),氯化钠(0.6%W / V)和稀王水bidest这些组件。制备的溶液,在高压灭菌器消毒,然后准备使用。
- 对于细菌用琼脂(1.5%W / V)的LB琼脂平板已经被添加到前杀菌的LB培养基。
- 在微波加热直到完全溶解的LB琼脂的LB琼脂。让我们冷静下来解决方案可触及,直到瓶子很容易灼伤。选择阳性克隆进一步的步骤添加卡那霉素(100毫克/毫升)。
- 吹打LB琼脂溶液20毫升到10厘米的Petri菜,准备在层流工作台(无菌条件下)的LB琼脂平板。让板冷静下来,直到液体已成为坚实的。板块现在已经准备好使用,并可以储存在4 ° C。
- 编码shRNA的表达载体转化为主管大肠杆菌大肠杆菌 ceq221热休克, 使用氯化钙程序。
- 含100μg/ ml卡那霉素的LB琼脂板的板转化菌,盖上盖子,用封口膜密封板和培育倒挂在37 °彗星在夜间。
- 采摘生长的菌落,用牙签,接种细菌阳性克隆的迷你文化。转移到7.0毫升含100毫克/毫升卡那霉素和培养在37℃以上夜间在200转筛的新鲜LB培养基牙签。
- 接种100毫升的新鲜LB培养基含37 100 mg / ml的卡那霉素1:100迷你文化在夜间,在1升的锥形瓶中,并培育℃以上夜间在200转筛。
- 种子25 × 10 4(种子细胞的数量取决于根据细胞株的细胞生长速度;汇合应播种后24小时〜70-80%)人胃癌细胞每孔(EPG85 257RDB)6 -以及菜肴,并培育这些在37℃,5%的CO 2,水蒸汽在夜间饱和的气氛。
- 前癌细胞感染,超过TK RNAi载体含有大肠杆菌的夜间文化大肠杆菌是衡量一个光度计来确定的OD 600。稀释细菌的解决方案,直到0.5的光密度达到 (外径600 = 0.5 = 1.6 × 10 8细菌细胞/ ml)。
- 更换对FCS的培养基30分钟以前的细菌共同培养的癌细胞FCS含细胞培养液中。
- 1 × PBS洗两次细菌,并在无血清Leibovitz的L - 15培养基稀释。
- 添加稀释细菌癌细胞(感染复数=每个肿瘤细胞的细菌细胞的数量),在需要的教学语言和共同培育的细菌和2个小时的癌细胞在37 ° C。
- 合作培养的癌细胞后2小时内与1X x PBS洗两次,一旦与含血清的L - 15 100 U / ml青霉素,100微克/毫升链霉素,2.5微克/ 150微克/毫升霉素,莱博维茨培养基毫升庆大霉素,和100μg/ ml卡那霉素。
- 继续培养癌细胞在37℃,5%的二氧化碳 ,水蒸气饱和的气氛。
- 细菌治疗的效果,可以可视化的实时定量RT - PCR测定mRNA水平,荧光显微镜和免疫印迹分析蛋白水平,并与功能分析,如流式细胞仪分析,细胞增殖实验显示。 (如果需要,这些程序可以在详细描述)。
2)代表性的成果
如果协议是正确执行,其结果应与图所示的。
荧光显微镜
图1显示了三个小时后,细菌治疗的人胃癌细胞相比,未经处理的细胞(B)(a)在。围绕处理的细胞的细胞核,可以检测出细菌。
图1:荧光显微镜细菌治疗(1:500)后人类胃癌细胞和未经处理的人胃癌肿瘤细胞作为对照,DAPI染色,DAPI带通滤波器(Λem= 640纳米),40倍的目标。
实时定量RT - PCR
一个约70%的MDR1 mRNA的下调(黑梁)图2可以看出,治疗后与治疗细菌。亲代细胞作为阳性对照,由于缺乏MDR1基因的过度表达。 257RDB P170包括细胞株的质粒表达抗多药耐药基因的shRNA小号transkingdom RNAi技术直接比较其他RNAI沉默策略。未经处理的耐药细胞株EPG85 257RDB过度表达的多药耐药,缺乏的shRNA表达质粒的细菌处理相同的细胞系,并治疗细菌携带质粒表达反MRP2的shRNA治疗这个细胞系作为阳性对照。
图2:实时定量RT - PCR MDR1基因治疗后与治疗大肠杆菌 mRNA的表达大肠杆菌 ceq221表达抗多药耐药基因的shRNA(教学语言1:500)。用看家基因醛缩酶正常化。未经处理的细胞的细胞线EPG85 257RDB MDR1/aldolase比例分别为100%。使用学生的t -检验计算P值(* = P <0.05,** = P <0.005,*** P <0.001)。
Western blot分析
图3显示多药耐药基因也下调了细菌处理后的蛋白质水平上进行。这显示缺乏父母的药物敏感细胞株(EPG85 257P),未经处理的耐药细胞株(EPG85 257RDB)MDR1的表达和处理的样品MDR1的表达MDR1的表达。可以观察到的细菌处理的细胞MDR1的一个明显的下调。
图3:免疫印迹分析未经处理的药物敏感EPG85 - 257P MDR1的表达水平,未经处理的耐药EPG 257RDB,EPG85 - 257RDB与E.共同孵育后。 大肠杆菌 ceq221 + P43 MDR1的。小学AB C219 1:100,抗肌动蛋白二级AB抗鼠1:10 000 1:5 000。
细胞毒试验
如图4所示的细胞毒性实验等功能的分析也transkingdom的RNAi的运作指标。亲本细胞株和ANIT - MDR1基因的shRNA表达质粒的细胞株,其中包含不显示任何柔红霉素的阻力。耐药细胞株EPG85 257RDB和另外两个对照组不显示在抗多药耐药基因的shRNA表达柔红霉素的阻力可以逆转约90%的细菌处理的样品相比,在电阻的显着变化。
图4:细胞毒试验。药物由一个细胞存活的细胞毒试验的具体确定的IC50值。使用学生的t -检验计算P值(* = P <0.05,** = P <0.005,*** P <0.001)。
蒽环类药物的积累检测
据降低细菌处理的样品的电阻(图4),蒽环类抗多药耐药基因的shRNA处理的细胞积累增加约90%,如图5所示。父母的细胞株和细胞系257RDB P170表现出强烈的柔红霉素积累高达100%。耐药变异显示很少任何积累。抗多药耐药基因的shRNA表达细菌处理的细胞显示anthracyline积累增加了90%。
图5:蒽环类药物的积累检测。蒽环类药物的积累通过流式细胞仪检测细菌治疗后6天的癌细胞。使用学生的t -检验计算P值(* = P <0.05,** = P <0.005,*** P <0.001)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
接种感染的细胞数和相应的教学语言的使用,关键取决于下观察细胞系,他们的增长速度。为了找到最佳的手机号码,播种,预实验,以确定的速度增长,强烈推荐。除此之外,不同的水分应进行测试,由于有限的延长,细胞可以站立,没有压力的死亡细菌的入侵。下观察基因的下调可能会有所不同的最佳时间点。建议执行超过一定的时间来寻找最佳条件内实验。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
授予没有工作是支持的。 01GU0615的“Bundesministerium献给Forschung和TECHNOLOGIE(BMBF)的。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar | Biochrom AG | 214050 | |
Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | |
Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | |
Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | |
Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
References
- Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).
- Lage, H. MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance. Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).
- Lage, H. An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem. Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).
- Lage, H. Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers. Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).
- Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing. Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).
- Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi. FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).
- Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference. Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).
- Stein, U. Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA. Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).
- Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals. Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).