Summary
من أجل التنمية التي تدخل الحمض النووي الريبي (رني) المستندة إلى علاجات ، تم وضع استراتيجية جديدة ، transkingdom رني (tkRNAi). هذه التكنولوجيا تستخدم البكتيريا المسببة للأمراض غير أن إنتاج وتسليم علاجية قصيرة الحمض النووي الريبي دبوس (shRNA) إلى الخلايا المستهدفة. هنا ، تم تطبيقها بنجاح tkRNAi لعكس الكلاسيكية المقاومة للأدوية المتعددة ABCB1 بوساطة (MDR) من خلايا السرطان.
Abstract
تدخل الحمض النووي الريبي (رني) يمثل آلية فعالة لكبح ارتفاع معين من التعبير مرنا. إلى جانب قدرتها كأداة قوية المختبر ، وطريقة رني يبدو واعدا للاستخدام العلاجي. من أجل التنمية التي تدخل الحمض النووي الريبي (رني) القائم على العلاجات ، وتقديم وساطة وكلاء - رني إلى الخلايا المستهدفة هي واحدة من العقبات الرئيسية. استراتيجية جديدة للتغلب على هذه العقبة هو transkingdom رني (TK رني). هذه التكنولوجيا تستخدم البكتيريا المسببة للأمراض غير ، مثل القولونية ، لإنتاج وتقديم العلاج القاسي قصيرة الحمض النووي الريبي (shRNA) إلى الخلايا المستهدفة للحث رني. والجيل الأول رني TK - التوسط النواقل ، والرحلة ، ويحتوي على مروج T7 عاثية لتنظيم التعبير عن shRNA العلاجية الفائدة. وعلاوة على ذلك ، رحلة له موضعا للإستثمار من يرسينيا الكاذبة التي تكود الإنفازين ، الذي يسمح البكتيريا الطبيعية موسع لدخول β1 - إنتغرين إيجابية خلايا الثدييات وهذا الجين من HlyA المستوحدة الليستيريا ، التي تنتج listeriolysin O. هذا الانزيم يسمح للshRNA العلاجية للهروب من دخول حويصلات داخل سيتوبلازم الخلية المستهدفة. وقدم يبني رحلة إلى غير الممرضة المختصة سلالة القولونية ، والذي بترميز T7 بوليميريز الحمض النووي الريبي اللازمة لتوليف المروج يحركها من shRNAs T7. وتتميز جيدا الجزيء المستهدف المرتبطة بالسرطان لاستراتيجيات مختلفة رني ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein ، MDR1/P-gp). هذا - ABC نقل المخدرات بمثابة مضخة البثق ويتوسط "الكلاسيكية" والمقاومة للأدوية المتعددة ABCB1 بوساطة (MDR) النمط الظاهري للخلايا السرطانية البشرية التي يتميز نمط عبر مقاومة معينة. وعولج ABCB1 - معربا عن الخلايا السرطانية المختلفة MDR المضادة للABCB1 shRNA التعبير ناقلات تحمل E. القولونية. أدى هذا الإجراء في تفعيل مسارات رني داخل الخلايا السرطانية وأسفل لائحة كبيرة من مرنا الترميز ABCB1 فضلا عن قذف المخدرات مضخة المقابلة. تبعا لذلك ، تم تعزيز تراكم المخدرات في الخلايا السرطانية البكر المقاوم للأدوية ، وكان عكس النمط الظاهري MDR. من خلال هذا النموذج توفير بيانات إثبات صحة مفهوم المعارف التقليدية رني مناسبة للتعديل من العوامل المرتبطة بالسرطان ، على سبيل المثال ABCB1 ، في خلايا السرطان البشرية.
Protocol
1) تسليم البكتيرية من shRNAs
- قبل أن تبدأ مع ثقافة البكتيرية ، وعلى المرء أن يعد LB - LB والمتوسطة أجار.
- LB للوزن المتوسط من خلاصة الخميرة (0.5 ٪ ث / ت) ، bacto تريبتون (1.0 ٪ ث / ت) ، وكلوريد الصوديوم (0.6 ٪ وزن / V) ، وتمييع هذه المكونات في bidest ماء. الحلول يجب أن تكون مستعدة تعقيمها في الأوتوكلاف ويتم بعد ذلك جاهزة للاستخدام.
- لوحات LB - أغار أغار bacto (1.5 ٪ ث / ت) والتي يمكن ان تضاف الى متوسطة LB السابقة للتعقيم.
- تسخين LB - أجار في فرن الميكروويف حتى يذوب تماما LB - آغار. اسمحوا الحل يبرد حتى يمكن لمس زجاجة بسهولة دون الحصول على حرق. إضافة الكانامايسين (100 ملغ / مل) لاختيار من الحيوانات المستنسخة في اتخاذ مزيد من الخطوات الايجابية.
- إعداد لوحات LB - أغار على مقاعد البدلاء تدفق الصفحي (ظروف معقمة) بواسطة pipetting 20 مل من محلول LB - آغار إلى 10 سم ، وبيتري ، الأطباق. السماح لوحات حتى يبرد السائل أصبحت صلبة. لوحات أصبحت الآن جاهزة للاستخدام ، ويمكن تخزينها في 4 درجات مئوية.
- يتم تحويل ناقلات التعبير ShRNA ترميز المختصة في E. القولونية ceq221 بواسطة الصدمة الحرارية باستخدام CaCl 2 الداخلي.
- لوحة البكتيريا على تحويل LB - آغار لوحات تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الكانامايسين ، إغلاق الغطاء ، وختم لوحات مع parafilm وزراعة رأسا على عقب في 37 درجة مئوية خلال الليل.
- تلقيح الثقافات البكتيرية مصغرة مع الحيوانات المستنسخة إيجابية عن طريق التقاط المستعمرات نمت مع اختيار الأسنان. نقل الأسنان في اختيار 7.0 مل من الطازجة المتوسطة LB تحتوي على 100 ملغ / مل الكاناميسين وزراعة بنسبة 37 درجة مئوية خلال الليل على شاكر في 200 دورة في الدقيقة.
- تطعيم 100 مل من جديد LB متوسطة تحتوي على 100 ملغ / مل الكاناميسين 1:100 مع الثقافة الليل فوق مصغرة في دورق مخروطي ل 1 ، واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل على شاكر في 200 دورة في الدقيقة.
- البذور 25 × 10 4 (عدد خلايا المصنف يعتمد على سرعة نمو الخلايا من خط الخلية حسب ، وينبغي أن يكون confluency ~ 70-80 ٪ بعد 24 ساعة من البذر) خلايا سرطان المعدة (EPG85 - 257RDB) لكل بئر في 6 -- الصحون جيدا واحتضان هذه عند 37 درجة مئوية ، في جو CO 2 ، 5 ٪ بخار الماء المشبع طوال الليل.
- السابقة للإصابة بسرطان الخلية ، على الثقافات يلة E. المعارف التقليدية التي تحتوي على النواقل رني تقاس القولونية في مضواء لتحديد OD 600. تمييع الحل الجرثومية حتى في كثافة ضوئية من 0.5 يتم التوصل (OD 600 = 0.5 يساوي 1.6 × 10 8 خلايا بكتيرية / مل).
- استبدال زراعة الخلايا التي تحتوي على السفح المتوسطة للخلايا سرطان ضد FCS خالية المتوسط 30 دقيقة السابقة لالبكتيرية شارك في الحضانة.
- يغسل البكتيريا مرتين مع PBS × 1 ، وتمييع في المصل خالية يبوفيتش المتوسطة 15 L.
- إضافة البكتيريا المخفف لخلايا السرطان في وزارة الداخلية المطلوب (تعدد الإصابة = عدد الخلايا البكتيرية في الخلايا السرطانية) ، وشارك في احتضان البكتيريا والخلايا السرطانية لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
- بعد غسلها 2 ساعة من الخلايا السرطانية المشترك حضانة مرتين مع 1X X مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني والمحتوية على مصل المتوسطة يبوفيتش - 15 L تستكمل مع 100 ش / البنسلين مل ، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين ، و 2.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين ، 150 ميكروغرام / جنتاميسين مل و 100 ميكروغرام / مل الكانامايسين.
- مواصلة زراعة الخلايا السرطانية عند 37 درجة مئوية ، في جو CO 2 ، 5 ٪ بخار الماء المشبعة.
- ويمكن لآثار العلاج الجرثومي يمكن تصور بواسطة المجهر الفلورسنت ، وتقاس كمية RT PCR الوقت الحقيقي على مستوى مرنا ، وتحليل لطخة غربية على مستوى البروتين ، وتظهر مع المقايسات الفنية مثل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية ، والمقايسات تكاثر الخلايا. (إذا أراد ، ويمكن وصف هذه الإجراءات بالتفصيل).
نتائج الممثل 2)
إذا تم تنفيذ البروتوكول بشكل صحيح ، يجب أن تكون النتائج مماثلة لتلك المبينة أدناه.
مضان المجهر
الشكل 1 يظهر الإنسان خلايا سرطان المعدة بعد ثلاث ساعات من العلاج الجرثومي (أ) مقارنة لخلية غير المعالجة (ب). حول نواة الخلية المعالجة ، ويمكن الكشف عن البكتيريا.
الشكل 1 : المجهري نيون الإنسان خلية سرطان المعدة بعد العلاج الجرثومي (1:500) ، وعلاج سرطان المعدة الخلية البشرية والسيطرة ، تلوين دابي ، ممر الموجة مرشح دابي (Λem = 640 نانومتر) ، والهدف 40X.
الكمية في الوقت الحقيقي RT PCR
في الشكل (2) يمكن أن ينظر إليها من أسفل لائحة MDR1 مرنا من حوالي 70 ٪ (شعاع السوداء) بعد العلاج مع البكتيريا العلاجية. الخلايا الأبوية بمثابة مراقبة إيجابية نظرا لعدم وجود MDR1 overexpression. خط خلية 257RDB p170 تحتوي على البلازميد معربا عن مكافحة MDR1 shRNAs ق تؤخذ على المقارنة المباشرة للتكنولوجيا رني transkingdom إلى R الأخرىناي إسكات الاستراتيجيات. وقد اتخذت من دون علاج خط خلية مقاومة EPG85 - 257RDB overexpressing MDR1 ، خط الخلية نفسها تعامل مع الجراثيم التي تفتقر إلى التعبير عن shRNA البلازميد ، وهذا خط الخلية تعامل مع البكتيريا العلاجية يحمل البلازميد معربا عن مكافحة MRP2 shRNAs والضوابط الإيجابية.
الشكل 2 : الكمي في الوقت الحقيقي RT PCR مرنا MDR1 التعبير بعد العلاج مع E. العلاجية القولونية ceq221 معربا عن مكافحة MDR1 shRNAs (وزارة الداخلية 1 : 500). تم تنفيذ التطبيع باستخدام الجينات ألدولاز التدبير المنزلي. تم تعيين نسبة من الخلايا غير المعالجة MDR1/aldolase من خط الخلية EPG85 257RDB - 100 ٪. حسبت ف القيم وطالب باستخدام اختبار t (* = P <0.05 ، ** = P <0.005 ، *** = P <0.001).
تحليل لطخة غربية
الشكل 3 يبين أن MDR1 أسفل اللائحة كما جرت على مستوى البروتين بعد المعالجة البكتيرية. انه يظهر تفتقر MDR1 تعبير عن المخدرات الحساسة خط الخلية الوالدية (EPG85 - 257P) ، والتعبير MDR1 خط خلية مقاومة المخدرات غير المعالجة (EPG85 - 257RDB) والتعبير MDR1 من العينة المعالجة. يمكن ملاحظة وجود تنظيم واضح من أسفل MDR1 من الخلايا المعالجة البكتريا. 
الشكل 3 : تحليل لطخة غربية مستويات التعبير MDR1 من دون علاج المخدرات الحساسة 257P - EPG85 ، وعلاج السل المقاوم للEPG - 257RDB ، و257RDB - EPG85 بعد حضانة بالتعاون مع هاء. القولونية ceq221 + MDR1 P43. الابتدائية آب C219 1:100 ، ومكافحة أكتين - 000 01:05 ، ثانوية أب لمكافحة فأر 01:10 000.
السمسة مقايسة
التحليل الوظيفي مثل مقايسة السمسة هو مبين في الشكل 4 هي أيضا مؤشرات لأداء رني transkingdom. خط الخلية الوالدية وخط الخلية التي تحتوي على shRNA anit - MDR1 معربا عن البلازميد لا تظهر أي مقاومة داونوروبيسين. خط خلية مقاومة EPG85 - 257RDB واثنين من عناصر تحكم أخرى لا تظهر تغيرات كبيرة في المقاومة في العينة مقارنة مع المعالجة المضادة للبكتيريا shRNA MDR1 الإعراب حيث يمكن عكس مقاومة داونوروبيسين بنحو 90 ٪.
الشكل 4 : مقايسة السمسة. المخدرات محددة IC50 قيم تحدده مقايسة السمسة للبقاء الخلية. حسبت ف القيم وطالب باستخدام اختبار t (* = P <0.05 ، ** = P <0.005 ، *** = P <0.001).
أنثراسيكلين تراكم مقايسة
وفقا لخفض مقاومة البكتريا للعينات المعالجة (الشكل 4) ، ويتم زيادة تراكم الخلايا أنثراسيكلين shRNA مكافحة MDR1 يعامل بها حوالي 90 ٪ كما هو مبين في الشكل 5. خط الخلية الوالدية وخط خلية 257RDB p170 تظهر تراكما داونوروبيسين قوية تصل إلى 100 ٪. متغير المقاوم نادرا ما يظهر أي التراكم. خلايا تعامل مع البكتيريا shRNA المضادة للتعبير عن MDR1 تظهر زيادة تراكم anthracyline من 90 ٪.
الشكل 5 : أنثراسيكلين مقايسة التراكم. أنثراسيكلين تراكم خلايا سرطان 6 أيام بعد المعالجة البكتيرية يقاس التدفق الخلوي. حسبت ف القيم وطالب باستخدام اختبار t (* = P <0.05 ، ** = P <0.005 ، *** = P <0.001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عدد الخلايا المصنف للعدوى واستخدمت وزارة الداخلية المقابلة ، وتعتمد بشكل كبير على خطوط الخلايا تحت الملاحظة وسرعة نموها. العثور على أرقام الهواتف المحمولة الأمثل لبذر ، يوصى بشدة قبل التجارب لتحديد سرعة النمو. وبالاضافة الى هذا ، يجب اختبار موييس مختلفة بسبب محدودية تمتد إلى الخلايا التي يمكن أن تقف على الغزو الجرثومي دون أن يموت من الإجهاد. النقطة المثلى من الوقت حيث التنظيم إلى أسفل من الجين تحت الملاحظة قد تختلف. فمن المستحسن لإجراء تجارب على مدى فترة معينة من الوقت للعثور على أفضل الظروف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد العمل الذي لا منحة. 01GU0615 من "Bundesministerium FÜR تكنولوجي اوند الإضافية اطلعوا (BMBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | |
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | |
| Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
References
- Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).
- Lage, H. MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance. Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).
- Lage, H. An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem. Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).
- Lage, H. Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers. Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).
- Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing. Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).
- Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi. FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).
- Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference. Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).
- Stein, U. Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA. Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).
- Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals. Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).
