Summary
Para el desarrollo de la interferencia de ARN (RNAi), las terapias basadas en una nueva estrategia se ha desarrollado, transkingdom RNAi (tkRNAi). Esta tecnología utiliza bacterias no patógenas para producir y entregar terapéutica de horquilla corta RNA (shRNA) en las células diana. Aquí, tkRNAi se aplicó con éxito para la reversión de la resistencia a múltiples fármacos clásicos ABCB1 mediada (MDR) de las células cancerosas.
Abstract
ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo altamente efectivo para la inhibición específica de la expresión del ARNm. Además de su potencial como herramienta de laboratorio poderosa, la vía de RNAi parece ser prometedora para la utilización terapéutica. Para el desarrollo de la interferencia de ARN (RNAi), las terapias basadas en la entrega de RNAi agentes mediadores de las células diana es uno de los principales obstáculos. Una nueva estrategia para superar este obstáculo es transkingdom RNAi (tk RNAi). Esta tecnología utiliza bacterias no patógenas, por ejemplo, Escherichia coli, para producir y entregar terapéutica de horquilla corta RNA (shRNA) en las células diana para inducir RNAi. Una primera generación de los conocimientos tradicionales RNAi mediar vector, viaje, contiene el promotor del bacteriófago T7 para la regulación de la expresión de un ARNhc terapéuticas de interés. Además, el lugar ha VIAJE Inv de Yersinia pseudotuberculosis que codifica invasina, lo que permite bacterias naturales no invasivas para entrar β1-integrina-positivo células de mamíferos y el gen HlyA de Listeria monocytogenes, que produce listeriolisina O. Esta enzima permite la shRNA terapéutica para escapar de la entrada de vesículas en el citoplasma de la célula diana. Construye TRIP se introducen en un tribunal competente no patógena cepa de Escherichia coli, que codifica la ARN polimerasa T7 necesarios para la T7 promotor impulsado por la síntesis de shRNAs. A bien caracterizados asociados con el cáncer molécula diana de las diferentes estrategias de RNAi es ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Esta ABC-transportador actúa como una bomba de extrusión de drogas y media la "clásica" ABCB1 mediada por la resistencia a múltiples fármacos (MDR) fenotipo de las células de cáncer humano que se caracteriza por un patrón de resistencia cruzada específica. ABCB1 diferentes que expresan las células cancerosas MDR fueron tratados con anti-ABCB1 del shRNA vector de expresión E. rodamientos coli. Este procedimiento dio lugar a la activación de las vías de ARNi en las células cancerosas y una regulación considerable abajo del ARNm que codifica ABCB1, así como la bomba de extrusión de drogas correspondiente. En consecuencia, la acumulación del fármaco fue mayor en las células cancerosas resistentes a los medicamentos prístina y el fenotipo MDR fue revocada. Por medio de este modelo los datos que presente la prueba de concepto que los conocimientos tradicionales RNAi es adecuado para la modulación de los factores asociados con el cáncer, por ejemplo, ABCB1, en células de cáncer humano.
Protocol
1) Entrega bacteriana de shRNAs
- Antes de comenzar con el cultivo bacteriano, uno tiene que preparar LB-medio y LB-agar.
- Para el LB-medio pesar de extracto de levadura (0,5% w / v), Bacto triptona (1,0% w / v) y NaCl (0,6% w / v) y diluir estos componentes en agua bidestilada. Las soluciones preparadas deben ser esterilizados en autoclave y luego se vaya a utilizar.
- Para las placas de agar-agar LB bacto (1,5% w / v) se debe añadir a la LB-medio anteriores a la esterilización.
- Calentar el LB-agar en el microondas hasta que el LB-agar se disuelva por completo. Deje que la solución se enfríe hasta que la botella se puede tocar con facilidad sin quemarse. Añadir a la kanamicina (100 mg / ml) para la selección de clones positivos en los siguientes pasos.
- Preparar agar LB-placas en un banco de flujo laminar (condiciones estériles) con la pipeta 20 ml de la solución de LB-agar en 10 cm de placas Petri. Deje que las placas de enfriamiento hasta que el líquido se ha convertido en sólidos. Las placas están listas para usar y se puede almacenar a 4 ° C.
- ARNhc de codificación de vectores de expresión se transformó en E. competentes ceq221 coli por choque térmico mediante el procedimiento de CaCl2.
- Placa de las bacterias transformadas en placas de agar LB que contienen 100 mg / ml de kanamicina, cerrar la tapa, sellar las placas con parafilm y cultivar al revés a 37 ° C durante la noche.
- Inocular bacterias culturas mini clones positivos recogiendo colonias crecido con un palillo. Transferir el diente recoger en 7,0 ml de agua dulce LB-medio que contiene 100 mg / ml de kanamicina y cultivar a 37 ° C durante la noche en un agitador a 200 rpm.
- Inocular 100 ml de agua dulce-LB medio que contiene 100 mg / ml kanamicina 1:100 con la cultura de la noche a través de mini en un 1 l erlenmeyer, y se incuba a 37 ° C durante la noche en un agitador a 200 rpm.
- Semillas de 25 x 10 4 (número de células sembradas depende de la velocidad de crecimiento de las células de la línea celular de acuerdo; confluencia debe ser ~ 70-80% 24 horas después de la siembra) las células humanas del carcinoma gástrico (EPG85-257RDB) por pocillo de 6 - platos bien e incubar estas a 37 ° C, en una atmósfera de 5% CO 2, vapor de agua saturado durante la noche.
- Anterior a la infección de las células cancerosas, sobre las culturas noche de los conocimientos tradicionales RNAi vector que contiene E. coli se miden en un fotómetro para determinar el OD 600. Diluir la solución bacteriana hasta una densidad óptica de 0,5 se llega a (OD 600 = 0,5 equivale a 1,6 x 10 8 células bacterianas / ml).
- Vuelva a colocar el medio celular que contiene FCS-cultura de las células de carcinoma contra FCS medio libre de 30 minutos anteriores a las bacterias co-incubación.
- Lávese las bacterias dos veces con 1 x PBS, y se diluye en suero libre de Leibovitz medio L-15.
- Añadir bacterias diluido a las células cancerosas en que desee MOI (multiplicidad de infección = número de células bacterianas por células cancerosas) y las bacterias co-incubación y las células cancerosas durante 2 horas a 37 º C.
- Después de 2 horas de las células del cáncer co-incubación se lavaron dos veces con 1 x PBS y una vez con el suero que contienen Leibovitz L-15 suplementado con 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2.5 mg / ml de anfotericina, 150 mg / ml de gentamicina, y 100 ug / ml de kanamicina.
- Continuar con el cultivo de las células cancerosas a 37 ° C, en una atmósfera de 5% CO 2, vapor de agua saturada.
- Los efectos del tratamiento bacteriano puede ser visualizado por microscopía de fluorescencia, medidos por PCR cuantitativa en tiempo real RT en el nivel de ARNm y por Western blot en el nivel de proteínas, y se muestra con ensayos funcionales como el análisis de FACS, y ensayos de proliferación celular. (Si se desea, estos procedimientos pueden ser descritos en detalle).
2) Los resultados representativos
Si el protocolo se realiza correctamente, los resultados deben ser comparables a las que se muestran a continuación.
Microscopía de fluorescencia
La figura 1 muestra una célula humana carcinoma gástrico tres horas después del tratamiento bacteriano (a) en comparación con una célula no tratada (b). Alrededor del núcleo de la célula tratada, las bacterias pueden ser detectados.
Figura 1: microscopía de fluorescencia de células humanas de carcinoma gástrico después del tratamiento bacteriano (1:500) y un sin tratar de células humanas de carcinoma gástrico como el control, DAPI mancha, DAPI banda pasante del filtro (Λem = 640 nm), el objetivo de 40x.
Cuantitativa en tiempo real RT-PCR
En la figura 2 una regulación a la baja de MDR1 ARNm de aproximadamente 70% (rayo negro) se puede ver después del tratamiento con las bacterias terapéuticas. Células de los padres sirven como control positivo debido a la falta de MDR1 sobre-expresión. La línea celular 257RDB p170 que contiene un plásmido que expresa anti-MDR1 shRNAs s tomado como una comparación directa de la tecnología de RNAi transkingdom a otras organizaciones de INAi silenciar las estrategias. La línea de células resistentes no tratados EPG85-257RDB sobreexpresión de MDR1, la misma línea celular tratados con bacterias que carecen de la expresión del shRNA plásmido, y esta línea de células tratadas con bacterias terapéuticas que lleva un plásmido que expresa anti-MRP2 shRNAs fueron tomados como controles positivos.
Figura 2: cuantitativa en tiempo real RT-PCR la expresión del ARNm MDR1 después del tratamiento con fines terapéuticos E. coli ceq221 expresar anti-MDR1 shRNAs (MOI 1: 500). La normalización se realizó con la aldolasa limpieza de genes. La relación MDR1/aldolase de las células no tratadas de la línea celular EPG85-257RDB se crearon 100%. P-valores se calcularon utilizando la t de Student-test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Western blot
La figura 3 muestra que el MDR1 por la regulación también se llevó a cabo en el nivel de proteína bacteriana después del tratamiento. Esto demuestra la falta de MDR1 expresión de la droga sensible a la línea celular parental (EPG85-257P), la expresión de MDR1 de la línea celular de drogas sin tratamiento resistente (EPG85-257RDB) y la expresión de MDR1 de la muestra tratada. Una regulación clara abajo de MDR1 de las células tratadas con bacterias se pueden observar. 
Figura 3: Análisis de Western blot MDR1 los niveles de expresión de los no tratados con drogas sensibles EPG85-257P, el grupo no tratado resistente a los medicamentos EPG-257RDB, y de EPG85-257RDB después de co-incubación con E.. coli ceq221 + P43 MDR1. Ab primaria C219 1:100 y anti-actina 1:5 000, Ab secundario anti-ratón de 1:10 000.
Citotoxicidad ensayo
El análisis funcional como el ensayo de citotoxicidad se muestra en la figura 4 también son indicadores para el funcionamiento de la RNAi transkingdom. La línea celular de sus padres y la línea celular que contiene un ARNhc anit-MDR1 expresar plásmido no muestran resistencia a la daunorubicina. La línea celular resistente EPG85-257RDB y dos controles posteriores no mostraron cambios significativos en la resistencia en comparación con la muestra tratada con anti-bacterias del shRNA expresar MDR1 donde podría ser la resistencia a la daunorubicina invertido en un 90%.
Figura 4: ensayo de citotoxicidad. Drogas específicas IC50-valores determinados por un ensayo de citotoxicidad para la supervivencia celular. P-valores se calcularon utilizando la t de Student-test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
Antraciclina ensayo de acumulación
De acuerdo con la disminución de la resistencia bacteriana de las muestras tratadas (Figura 4), la acumulación de antraciclina de anti-células MDR1 siRNA tratados se incrementa alrededor de un 90% como se muestra en la figura 5. La línea celular de sus padres y la línea celular 257RDB p170 muestran una acumulación daunorubicina fuerte hasta el 100%. La variante resistente a la muestra suele haber acumulación. Las células tratadas con anti-bacterias MDR1 ARNhc expresar muestran un aumento de la acumulación de antraciclina de 90%.
Figura 5: ensayo de antraciclina de acumulación. Antraciclina acumulación de células de carcinoma de seis días después del tratamiento bacteriano mediante citometría de flujo. P-valores se calcularon utilizando la t de Student-test (* = p <0,05, ** = p <0,005, *** = p <0,001).
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Discussion
El número de células sembradas para la infección y se utiliza el MOI correspondientes, dependen fundamentalmente de las líneas celulares en observación y su velocidad de crecimiento. Para encontrar números de celular óptimo para la siembra, pre-experimentos para determinar la velocidad de crecimiento son muy recomendables. Además de esto, las MOI diferentes deben ser probados debido a la limitada se extiende a que las células pueden resistir la invasión bacteriana sin morir de estrés. El punto óptimo de tiempo donde la regulación a la baja del gen bajo observación puede variar. Se recomienda llevar a cabo experimentos en un período determinado de tiempo para encontrar las condiciones óptimas.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El trabajo fue financiado por el subsidio no. 01GU0615 del "Bundesministerium für Forschung und Technologie de Alemania (BMBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | |
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | |
| Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
References
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