Summary
De kroon van de verschillende regio V3 lus sequenties van het oppervlak enveloppe glycoproteïne (gp120) van HIV-1 kan structureel worden gekarakteriseerd in veel gevallen door in silico vouwing van de posities 10 tot 22 van de lus met behulp van een state-of-the-art
Abstract
De antigene diversiteit van HIV-1 is al lang een obstakel voor vaccins design, en deze variabiliteit is vooral uitgesproken in de V3 lus van het oppervlak van het virus 'enveloppe glycoproteïne. We hebben eerder voorgesteld dat de kroon van de V3 lus, maar dynamische en volgorde variabele, is beperkt in de hele populatie van HIV-1 virussen naar een immunologisch relevante β-haarspeld tertiaire structuur. Belangrijk is, zijn er duizenden verschillende V3 lus kroon sequenties in circulerende HIV-1-virussen, het maken van 3D structurele karakterisering van ontwikkelingen in de diversiteit van virussen moeilijk of onmogelijk door de kristallografie en NMR. Onze eerdere succesvolle studies met vouwen van de V3 kroon 1, 2 gebruikte ab initio algoritme drie toegankelijk zijn in de ICM-Pro molecular modelling software pakket (Molsoft LLC, La Jolla, CA) en stelde voor dat de kroon van de V3 lus, in het bijzonder uit de posities 10 tot 22, voldoende voordelen van de flexibiliteit en de lengte van de flankerende stengels te gedragen voor een groot deel als ware het een ongedwongen peptide vrij te vouwen in oplossing. Als zodanig, snelle ab initio vouwen van alleen dit gedeelte van de V3 lus van een individuele stam van de 60.000 + circulerende HIV-1 stammen kunnen informatief zijn. Hier hebben we gevouwen de V3 lus van de R2 stam om inzicht te krijgen in de structurele basis van zijn unieke eigenschappen. R2 draagt een zeldzame V3 lus volgorde dacht verantwoordelijk te zijn voor de verfijnde gevoeligheid van deze stam tot een neutralisatie van de patiënt sera en monoklonale antilichamen 4, 5. De stam bemiddelt CD4-onafhankelijke infectie en lijkt op te wekken breed neutraliserende antilichamen. We zien hoe de evaluatie van de resultaten van het vouwen kan informatief zijn voor de inschakeling van waargenomen structuren in de vouwing van de immunologische activiteiten die worden waargenomen voor de R2.
Protocol
1. Methodologie
- De eerste stap van het protocol is het selecteren van de V3 kroon volgorde die u wilt vouwen in silico. Voor de R2 stam, de volgorde voor dit fragment is KSIPMGPGRAFYT.
- De 3D-atomaire structuur van het peptide dat overeenkomt met deze volgorde moeten worden gebouwd in de virtuele ruimte van de computer. De ICM commando hiervoor is:
buildpep "KSIPMGPGRAFYT"
of Bestand: Nieuw: Peptide kan worden geselecteerd in het kader van de pull-down menu - Verschillende parameters van de procedure zijn vervolgens, inclusief het aantal van search stappen (lengte van het zoeken), de simulatie temperatuur, zoekstrategie parameters met inbegrip van variabele beperkingen om vertekening van de zoektocht naar een redelijke gebieden, energie termen, keuze uit verschillende energie berekeningsmethoden, en parameters die aangeeft hoe de zoekopdracht wordt opgenomen, zoals de vraag of een film op te nemen en hoeveel tussenliggende scoren conformaties moet worden geregistreerd. Al deze parameters zijn geoptimaliseerd door eerdere publicaties (zie www.molsoft.com).
- Het vouwen wordt vervolgens gestart met het commando:
montecarlo
of Bestand: Nieuw: Peptide kan worden geselecteerd in het kader van de pull-down menu Moleculaire Mechanica: Minimize: Global
In het eerste geval moeten de parameters uit stap 3 worden een voor een in de opdrachtregel. In het laatste geval worden selectievakjes voor de meest gekozen parameters die in een paneel voordat de opdracht wordt uitgevoerd. Voor het gemak wordt dezelfde vouwen ICM script dat wordt gebruikt voor dit experiment en eerder gepubliceerde experimenten hier weergegeven:
Dit script kan worden opgeslagen in een tekstbestand en voer uit de bedrijfsactiviteiten van de computer command line (meestal LINUX) snel met het commando:
icm _foldingscript
2. Geheimen tot succes
- De V3 lus is een constante 35 aminozuren in lengte in bijna elke bekende stam, zodat de aminozuur posities zijn genummerd 1 tot 35 te beginnen met de uit disulfide gebonden cystine bij 1 en eindigt bij de bijbehorende disulfide gebonden cystine op 35. Omdat het deel uitmaakt van een lus, moet de grenzen van de kroon van V3 zorgvuldig worden gekozen. Als een te groot fragment is gekozen, het onwaarschijnlijk is om zich te gedragen als een vrij flexibel segment als ware het een vrij peptide, zodat de vouwen simulatie niet correct de structuur te beoordelen. Als een te kleine fragment is gekozen, kan de informatieve tertiaire structuur niet vorm in de simulatie. Onze voorafgaande studie toonde aan dat het fragment van positie 10 naar positie 22 gecorreleerd met antilichaam gebonden kristallografische conformaties, dus dit is het fragment van een V3 lus die moeten worden gekozen voor het vouwen.
- Hoewel het gebruik van de grafische gebruikersinterface en pull-down menu's is gebruiksvriendelijk, de eerdere succesvolle werk op peptide vouwen in het algemeen, met behulp van ICM en V3 lus kroon vouwen in het bijzonder de gebruikte script hierboven, gewoon het wijzigen van de volgorde in de buildpep lijn en het uitvoeren van de bovenstaande script vanaf de opdrachtregel wordt aanbevolen.
3. Representatieve resultaten
De resultaten voor de R2 vouwen representatief zijn voor de resultaten voor eventuele V3 lus. Het evalueren van de resultaten, moet het project-bestand (het zal de naam "newProject1.icb" uit de bovenstaande script), worden geopend en "Moleculaire Mechanica, Stack, View" gekozen. Een tabel van de stapel conformaties zal verschijnen. De stapel conformaties kan grafisch worden gevisualiseerd door te klikken op de Plot / Histogram icoon. "Moleculaire Mechanica, Stack, Play" zal een film maken van de stapel om visueel genieten van de conformationele voorkeuren ontdekt door de vouwen. Voor de R2 volgorde, de conformatie is beta-haarspeld-achtige zoals verwacht voor de V3 lussen 2 - met name in het fragment op de posities 12 tot 14, waar een duidelijke β-strand voorkeur wordt gezien overal in de hoop, en heel weinig alfa-helix conformaties worden gezien. Bovendien is een energie gap van bijna 3 eenheden gezien tussen de laagste energie conformatie en de een na laagste energie-conformatie. Vanuit een energetisch oogpunt betekent dit dat de structuur alleen flikkert uit van de laagste energie bouw minder dan een procent van de tijd: het vouwen resultaten dan ook suggereren dat de R2 V3 kroon is een stijve, in plaats van flexibele structuur. Er kunnen bijkomende belangrijke structurele kenmerken in het ensemble van conformaties, maar ze zijn moeilijk systematisch te waarderen.
| JRFL | SF162_V3JRFL | SF162_V3R2 | |
| 447-52d GMT 50 | 15 | 0,00061 | 0,00078 |
Tabel 1: Relatieve neutralisatie van JRFL en R2 V3 lussen in gemaskerde en ontmaskerd instellingen. De gegevens werden gerapporteerd in eerder Cardozo T., et al.. ARHR (2008) en Pinter, A., et. Al J. Virol (2004). In het kort werd neutraliserende activiteit bepaald met een single-cyclus met behulp van bepaling van het infectievermogen psVs gegenereerd met de env-defecte luciferase-expressie pNL4-3.Luc.RE-plasmide pseudogetypeerde met de JRFL ENV-of de SF162 V3 varianten hierboven beschreven: SF162_V3JRFL bevat de JRFL V3 lus volgorde in de plaats van de SF162 V3 lus volgorde. SF162_V3R2 bevat de R2 V3 lus volgorde in de plaats van de SF162 V3 lus volgorde. De psVs werden geïncubeerd met seriële verdunningen van het 447-52d mAb gedurende 1,5 uur bij 37 ° C, en vervolgens toegevoegd aan de CD4 + CCR5 + U87 doelcellen uitgeplaat in 96-well platen in de aanwezigheid van polybreen (10 mg = ml). Na 24 uur werden de cellen refed met RPMI medium dat 10% FBS en 10 mg = mL polybreen, gevolgd door een extra 24-48 uur incubatie. Luciferase-activiteit werd bepaald 48-72 uur postinfection met een microtiterplaat luminometer (Harta, Inc) met behulp van test reagentia van Promega, Inc Geometrisch gemiddelde titers voor 50% neutralisatie (GMT50) door 447-52d werden bepaald door interpolatie van de neutralisatie bochten en zijn gemiddelden van ten minste drie onafhankelijke testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ab initio vouwen onthult tertiaire structurele eigenschappen, de effecten van die niet blijken uit het bestuderen van individuele aminozuren sequentieel. Een aantal eerder obscure structurele eigenschappen van de R2 V3 lus kroon worden onthuld door de vouwen simulatie. Deze waargenomen structurele voorkeuren kunnen correleren met de waargenomen functionele eigenschappen van de R2 stam, namelijk de gevoeligheid voor neutralisatie en hyperinfectivity 5.
Eerst wordt een duidelijk β-strand tendens in de N-terminale helft van de R2 V3 kroon op de posities 12 tot 14 waargenomen. Dit is de locatie van ongebruikelijke de R2 stam van isoleucine-proline-methionine (IPM) sequentie. Van kristallografische structuren van het 447-52d, 2219, BE48, 2557, 2558 en 537-D anti-V3 lus antilichamen gebonden aan V3 lus peptiden, posities 12 tot 14 van de V3 lus zijn gebonden aan deze antilichamen, en, indien gebonden, het segment neemt een lokale β-strand conformatie. De opklapbare simulatie suggereert dus dat de R2-V3 lus kroon een bevestiging geeft de voorkeur aan op de posities 12 tot 14 dat complementair is aan bekende anti-V3 lus neutraliserende antilichamen. Deze voorkeur kan verklaren de waargenomen gevoeligheid voor neutralisatie van deze stam.
Ten tweede, de simulatie laat een gat van drie energie-eenheden tussen de laagste energie conformatie en de op een na laagste energie-conformatie, hetgeen duidt op een stijve structuur. HIV-1's gp120 is een zeer dynamisch molecule, die een grote conformationele verschuiving van zijn ongebonden, immunologisch beschermd (unliganded) vorm aan haar gebonden menselijke receptor en immunologisch blootgesteld (liganded) te vormen. Flexibiliteit van de V3 lus kan worden verlangd dat deze coöperatie overgangseffect, en de stijve R2 V3 lus structuur waargenomen hier kan verzetten tegen het verschuiven van de liganded vorm, net zoals een stijve blok wellicht moeilijker om weg te smullen in een kleine ruimte in vergelijking met een zachtere flexibele blok. Deze weerstand op de aanneming van de unliganded vorm kan blootstellen V3 lus, de CD4-bindingsplaats en CD4-geïnduceerde neutralisatie epitopen, die alle karakteristieke worden blootgesteld in de liganded vorm van gp120. Zo kan de waargenomen rigiditeit ook conceptueel worden aangesloten op de waargenomen neutralisatie gevoeligheid van de R2 stam.
Omdat de co-receptor interactie vorm van de V3 lus zal waarschijnlijk ook een β-haarspeld, zoals de vormen het doelwit van neutraliserende antilichamen worden, de resultaten suggereren dat de R2 V3 kroon is opgesloten in de co-receptor en neutraliserende antilichamen complementaire vorm, die op hun beurt kunnen bevorderen de hele gp120 in zijn liganded vorm, waardoor de stam zeer besmettelijk. Zo, de waargenomen conformationele voorkeur en stijfheid beide ook kan conceptueel worden geassocieerd met hyperinfectivity R2.
Deze regeling van een rigide, maar blootgesteld co-receptor en antilichaam complementaire conformatie van de V3 lus is verschillend van die van een flexibel, maar begraven of gemaskeerd V3 lus die typisch is voor HIV-stammen. Vouwen van de JRFL stam (die de consensus subtype B HIV-1-V3 lus reeks tentoonstellingen) blijkt ook een β-streng voorkeur, maar veel nauw verdeeld laagste energie conformaties die wijzen op V3 kroon flexibiliteit (gegevens niet getoond). De voorspelling zou zijn dat deze V3 lus volgorde zou zijn zeer gevoelig voor neutralisatie door een passend antilichaam, zoals 447-52d als het blootgesteld in plaats van begraven. Zoals verwacht, de JRFL en R2 sequenties zijn even gevoelig als gepresenteerd in een blootgestelde omgeving binnen een chimère SF162 pseudovirus waarin de V3 lus wordt vervangen door de JRFL of R2 V3 loops (tabel 1), maar dezelfde JRFL V3 lus is volledig ongevoelig tot een neutralisatie toen in haar eigen JRFL context.
Deze resultaten suggereren dat de ongebruikelijke IPM volgorde van de R2 stam een stijve, antilichaam-binding-site-compatibel zijn, co-receptor-binding-site compatibel zijn vorm in de belangrijkste kroon regio van de V3 lus verleent. De stijfheid wordt verondersteld om de conformationele flexibiliteit van gp120 belemmeren als het overgangen tussen liganded en unliganded vormen, vergrendelen het grotendeels in zijn liganded vorm waarbij het antilichaam-optimale, co-receptor-optimale vorm in de V3 kroon wordt blootgesteld en beschikbaar is. Het resultaat is een gevoeligheid voor neutralisatie en hyperinfectivity van de R2 stam. Op deze manier, de ab initio vouwen experiment beschreven in dit protocol is informatief voor HIV-vaccin onderzoek: de vouwing resultaten waargenomen voor R2 hier belangrijk kan zijn voor de HIV-1-vaccin immunogeen ontwerp als een aanwijzing voor hoe de gp120-based immunogenen vergrendelen bij voorkeur , neutralisatie gevoelige conformaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door subsidies van de Bill en Melinda Gates Foundation (# 38.631) en het NIH, inclusief DP2 OD004631 en R01 AI084119.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICM-Pro | Molsoft LLC |
References
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Zolla-Pazner, S. &, Cardozo, T. Dynamic characterization of the V3 loop crown. Antiviral Therapy. 12, 13-31 (2007).
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop. AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).
- Abagyan, R., Totrov, M. Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins. J Mol Biol. 235, 983-1002 (1994).
- Quinnan, G. V., Zhang, P. F., Fu, D. W., Dong, M., Alter, H. J. Expression and characterization of HIV type 1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response. AIDS Res Hum Retroviruses. 15, 561-5670 (1999).
- Zhang, P. F., Bouma, P., Park, E. J. A variable region 3 (V3) mutation determines a global neutralization phenotype and CD4-independent infectivity of a human immunodeficiency virus type 1 envelope associated with a broadly cross-reactive, primary virus-neutralizing antibody response. J Virol. 76, 644-655 (2002).
