Summary
HIV - 1의 표면 봉투 당단백질 (gp120)의 다른 V3 루프 시퀀스의 왕관 지역은 구조 위치의 silico 폴딩에 의해 대부분의 경우 특색 수있는 최첨단의를 사용하여 루프의 10-22
Abstract
HIV - 1의 antigenic 다양성 길이 백신 설계에 장애물을하고 있으며,이 변화는 특히 바이러스 '표면 봉투 당단백질의 V3 루프의 발음입니다. 우리는 이전에 V3 루프의 왕관,하지만 역동적이고 순서 변수, immunologically 관련 β - 헤어핀 차 구조 HIV - 1 바이러스의 인구에 걸쳐 제약이 있다고 제안했습니다. 중요한 것은, 다른 V3 루프 왕관 시퀀스 수천 crystallography 나 NMR에 의해 어렵거나 불가능 바이러스의 다양성에 걸쳐 트렌드의 3D 구조 특성 만들기, HIV - 1 바이러스를 순환에 있습니다. V3 왕관 1, 2 접는과 함께 이전의 성공적인 연구 ICM - PRO 분자 모델링 소프트웨어 패키지 (Molsoft LLC, 라 호야, CA)에 접근 순이 론적 알고리즘 3 사용하고 제안하는 V3 루프의 왕관, 구체적으로부터 위치 10-22 충분한 유연성과 자유롭게 솔루션 접는 거리낌없는 펩타이드 것처럼 큰 정도로 동작하기 위해 측면 줄기의 길이에서 혜택을 제공합니다. 60000의 개별 변형의 V3 루프의 그냥이 부분 등, 빠른 순이 론적 접는로 + 순환 HIV - 1 계통 정보를 수 있습니다. 여기, 우리는 독특한 속성의 구조적 기초에 대한 통찰력을 얻으려면 R2 변형의 V3 루프를 접어. R2는 환자와 단클론 항체 세라 4 5 중화이 변형의 아름다운 감성에 대한 책임 것으로 생각 드문 V3 루프 시퀀스를 맺는다. 변형 CD4 독립 감염 mediates하고 널리 중화 항체를 이끌어내는 것으로 나타났습니다. 우리는 접는의 결과 평가가 R2에 대한 관찰 면역 활동과 접는에서 관찰 구조와 연결에 대한 정보를 수있는 방법을 보여줍니다.
Protocol
1. 방법론
- 프로토콜의 첫 번째 단계는 silico에 접어하고자하는 V3 왕관 시퀀스를 선택합니다. R2 스트레인 들어,이 조각에 대한 시퀀스 KSIPMGPGRAFYT입니다.
- 이 순서에 해당하는 펩타이드의 3D 원자 구조는 컴퓨터의 가상 공간에 건설되어야합니다. 이에 대한 ICM 명령은 다음과 같습니다 :
buildpep "KSIPMGPGRAFYT"
또는 파일 : 새 : 펩타이드는 풀다운 메뉴에 따라 선택할 수 있습니다 - 절차의 몇 가지 매개 변수는 다음 검색 단계의 번호 (검색 길이), 시뮬레이션 온도, 바이어스 합리적인 지역 에너지 용어, 다른 에너지 계산 방법의 선택으로 검색을하기 위해 변수의 구속을 포함하여 검색 전략 매개 변수를 포함하여, 설정 그리고 검색이 같은 동영상을 기록 여부로 기록하고 얼마나 많은 중간 점수 conformations되는 방법을 나타내는 매개 변수가 기록되어야합니다. 이러한 모든 매개 변수는 이전의 출판물 (www.molsoft.com 참조)에 의해 최적화되었습니다.
- 접지는 다음 명령으로 시작됩니다 :
몬테 칼
또는 파일 : 새 : 펩타이드는 메뉴 분자 역학 풀다운에 따라 선택할 수 있습니다 : 최소화 : 글로벌
전자의 경우에는 3 단계의 매개 변수가 명령줄에 하나씩 설정해야합니다. 명령이 실행되기 전에 후자의 경우, 가장 일반적으로 선택한 매개 변수에 대한 확인란이 패널에 제공됩니다. 편의를 위해,이 실험 이전에 출판 실험 활용 같은 접이식 ICM 스크립트는 여기에 나와 있습니다 :
이 스크립트는 텍스트 파일에 저장하고 빠르게 명령을 사용하여 컴퓨터의 운영 체제 커맨드 라인 (일반적으로 리눅스)에서 실행할 수 있습니다 :
ICM _foldingscript
2. 성공의 비밀
- V3 루프는 거의 모든 알려진 변종의 길이는 상수 35 아미노산이며, 아미노산 위치가 1 시스틴 보세 원래 이황화 시작하여 35 시스틴 보세 해당 이황화과 종료 1에서 35 번호되도록. 그것이 루프의 일부이기 때문에, V3의 왕관의 경계를 신중하게 선택하여야한다. 너무 큰 조각을 선택한 경우는 무료 펩타이드 것처럼, 그것이 자유롭게 유연한 세그먼트로 동작하지 않을 수 있습니다, 접는 시뮬레이션이 제대로 구조를 평가되지 않습니다. 너무 작은 조각이 선택되면, 정보를 차 구조는 시뮬레이션에서 양식하지 않을 수 있습니다. 우리의 이전 연구는 위치 22 위치 10 조각은 항체 바운드 crystallographic conformations와 상관 것으로 나타났다, 그래서 이것은 접는 위해 선택되어야하는 V3 루프의 조각이다.
- 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하고 풀다운 메뉴는 사용자 친화이지만, 특히 ICM과 V3 루프 왕관 접는를 사용하여 일반적으로 펩타이드 접는에 이전 성공적인 작품은 단순히 buildpep 라인의 순서를 수정하고 실행 위의 스크립트를 사용하여 커맨드 라인에서 위의 스크립트를 권장합니다.
3. 대표 결과
R2의 접는에 대한 결과는 V3 루프에 대한 결과의 대표입니다. 결과를 평가하기 위해, 프로젝트 파일 (이것은 위의 스크립트에서 "newProject1.icb"라는 것입니다) 선택 "을 분자 역학, 스택,보기"개설하고 있어야합니다. 스택 conformations의 테이블이 나타납니다. 스택 conformations는 플롯 / 히스토그램 아이콘을 클릭하여 그래픽 시각하실 수 있습니다. "분자 역학, 스택, 재생"시각 접는에 의해 밝혀 conformational 환경 설정을 감사하는 스택의 영화를 만들 것입니다. R2 시퀀스의 경우 형태는 V3 루프 2 예상 베타 헤어핀 같은 것입니다 - 특히 위치에있는 조각에 12 깨끗한 β - 스트랜드 환경 설정이 스택에 걸쳐 볼 수 있으며 거의 알파 - 나선형 conformations입니다 14 볼 수 있습니다. 또한, 거의 3 단위의 에너지 격차가 가장 낮은 에너지 형태와 두 번째 낮은 에너지 형태 사이에서 볼 수 있습니다. 보기 활기 넘치는 관점에서,이 의미 낮은 에너지 형태의 구조는 깜박임 아웃 시간 미만 퍼센트 : 접는 결과는 따라서 R2 V3 왕관이 단단한보다는 유연한 구조로되어하는 것이 좋습니다. 이 conformations의 앙상블에 추가 중요한 구조적 기능을 수 있지만 그들은 체계적으로 감사하기가 어렵습니다 수 있습니다.
| JRFL | SF162_V3JRFL | SF162_V3R2 | |
| 447 - 52D 그리니치 표준시 50 | 15 | 0.00061 | 0.00078 |
표 1 : JRFL 및 R2 V3의 상대 중화가 가면과 가면 설정에서 루프. 데이터는 이전에 다음 ID로 카도조 T., 외. ARHR (200에서보고되었다8)와 핀터, A., 동부 표준시. 알 J. Virol (2004). SF162_V3JRFL 포함된 JRFL : 간단히, 중화 활동은 환경을 - 결함 루시페라제 - 표현 JRFL 환경을하거나 위에서 설명한 SF162 V3 변종과 함께 pseudotyped pNL4 - 3.Luc.RE - 플라스미드와 생성된 psVs을 사용하여 단일 사이클 감염 분석과 결정했습니다 SF162 V3 루프 시퀀스 대신에 V3 루프 시퀀스. SF162_V3R2는 SF162 V3 루프 시퀀스 대신에 R2의 V3 루프 시퀀스를 포함하고 있습니다. psVs는 37 1.5 H에 대한 447 - 52D mAb 일련 dilutions와 incubated했다 polybrene (10 MG = ML)의 면전에서 96 - 웰 플레이트에 도금 ° C, 그리고 CD4에 추가 + CCR5 + U87 대상 세포. 24 시간 후, 세포가 배양의 추가 24-48 H 다음 10% FBS 및 10 MG = ML polybrene을 포함하는 RPMI 매체와 refed되었습니다. 루시페라제 활동이 447 - 52D 50 %의 중화 (GMT50)에 대한 Promega (주) 기하 평균의 titers에서 분석 시약을 사용하여 microtiter 플레이트 luminometer (HARTA 주식 회사)와 48-72 H의 postinfection 결정되었고 중화 곡선의 보간에 의해 결정하고 있었다 적어도 세 독립 assays의 평균입니다.
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Discussion
순이 론적 접힘은 차 구조 특성, 순차적으로 각각의 아미노산을 공부에서 뚜렷하지 않을 수있는 효과를 나타낸다. R2 V3 루프 왕관 몇 가지 이전에 애매한 구조 특성은 접는 시뮬레이션에 의해 공개됩니다. 이러한 관찰 구조적 환경 즉 R2 스트레인, 중화 및 hyperinfectivity 5 감도의 관찰 기능 특성과 상관 관계 수 있습니다.
첫째, 위치 12-14에서 R2의 V3 크라운의 N - 터미널의 절반은 분명 β - 스트랜드 경향이 관찰됩니다. 이것은 R2 변형의 특이한 이소 류신 - 프롤린 - 메티오닌 (IPM) 순서의 위치입니다. V3 루프 펩티드, 위치 바운드 때 V3 루프의 12-14는이 항체에 의해 바운드, 그리고에 바인딩 crystallographic 447 - 52D의 구조, 2219, Be48, 2557, 2558 및 537 - D 백신 V3 루프 항체에서 세그먼트는 로컬 β - 스트랜드 형태를 채택. 접지 시뮬레이션 따라서 R2 V3 루프 왕관이 알려진 안티 - V3 루프 중화 항체를 보완합니다 12-14 위치에서 형태를 선호하는 것이 좋습니다. 이 환경 설정이 변형의 중화에 관찰된 감도를 설명합니다.
둘째, 시뮬레이션 단단한 구조를 제안, 가장 낮은 에너지 형태와 두 번째 낮은 에너지 형태 사이의 3 에너지 단위의 차이를 보여줍니다. HIV - 1 gp120는 언바운드에서 큰 conformational 변화, 형태 (liganded) immunologically 바운드은 인간의 수용체에 (unliganded) 양식을 보호하고 immunologically 노출을 필요로하는, 매우 역동적인 분자이다. V3 루프의 유연성은 단단한 블록에 비해 작은 공간에 떨어진 턱에 더 많은 문제가있을만큼,이 협력 전환 효과를 위해 필요한, 그리고 까다로운 R2의 V3 루프 구조는 liganded 양식의 밖으로 이동 저항 수 있습니다 여기를 관찰 수 있습니다 부드럽고 유연한 블록. unliganded 양식을 채택하는이 저항은 V3 루프, CD4 구속력이 사이트 특질상 gp120의 liganded 형태로 노출하는 모든 중 중화 epitopes을 유도 CD4에 노출될 수 있습니다. 따라서 관찰 강성도 개념 R2 변형의 관찰 중화 감도에 연결되어있을 수 있습니다.
V3 루프의 양식을 상호 공동 수용체 또한 중화 항체의 표적이 양식과 같은 β - 헤어핀 될 가능성이 있기 때문에, 결과는 R2 V3 크라운이 공동 수용체와 중화 항체 상호 보완적인 형태로 잠겨 것이 좋습니다있는 차례로 변형 높은 infective 만들기, 그 liganded 형태로 전체 gp120을 촉진 수도 있습니다. 따라서 관찰 conformational 특혜와 강성이 두 개념도 R2의 hyperinfectivity와 관련된 수 있습니다.
V3 루프의 단단한, 그러나 노출 공동 수용체와 항체 상호 보완적인 형태의이 배열은 유연한와는 별개이지만, HIV의 종자의 전형적인 V3 루프를 묻혀 또는 마스크. (합의의 subtype B HIV - 1 V3 루프 시퀀스를 전시) JRFL 변형의 접는 것은 또한 β - 스트랜드 선호하지만, V3 왕관의 유연성 (데이터가 표시되지 않음)의 암시 많은 밀접하게 분산 낮은 에너지 conformations을 보여줍니다. 예언은 그것이 노출 대신 묻혔다면이 V3 루프 시퀀스는 447 - 52D와 같은 적절한 항체에 의해 중화에 매우 민감한 것이 것입니다. 예상대로, V3 루프가 JRFL 또는 R2 V3 루프 (표 1)에 의해 대체되는 키메라 SF162 pseudovirus 이내에 노출된 환경에서 제시하면 JRFL과 R2 시퀀스는 동등하게 구분하지만, 같은 JRFL V3 루프 완전히 구분하지 않습니다 의 기본 JRFL 맥락에서 제시하면 중화합니다.
이러한 결과는 R2 변형의 특이한 IPM 시퀀스는 딱딱한, 항체 결합 사이트 호환, 공동 수용체 결합 사이트 V3 루프의 핵심 왕관 지역에서 호환 가능한 형태를 수여하는 것이 좋습니다. 강성은 크게 V3의 왕관에있는 항체 - 최적의 공동 수용체 - 최적 형상 노출하고 사용할 수 있습니다 그 liganded 형태로 그것을 잠금, liganded과 unliganded 양식 사이가 전환으로 gp120의 conformational 유연성을 방해하는 가상입니다. 그 결과 중화 및 R2 변형의 hyperinfectivity에 감도 있습니다. 이러한 방법으로,이 프로토콜에 설명되어있는 순이 론적 접이식 실험은 HIV 백신 연구에 대한 정보를합니다 : 여기 R2에 대한 관찰 접는 결과가 선호에 gp120 기반 immunogens을 잠금하는 방법에 대한 단서로서 HIV - 1 백신 immunogen 디자인에 중요있을 수 있습니다 , 중화 민감한 conformations합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
작품은 DP2 OD004631와 R01 AI084119 포함한 빌 앤드 멜린다 게이츠 재단 (# 38631)와 NIH에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICM-Pro | Molsoft LLC |
References
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Zolla-Pazner, S. &, Cardozo, T. Dynamic characterization of the V3 loop crown. Antiviral Therapy. 12, 13-31 (2007).
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop. AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).
- Abagyan, R., Totrov, M. Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins. J Mol Biol. 235, 983-1002 (1994).
- Quinnan, G. V., Zhang, P. F., Fu, D. W., Dong, M., Alter, H. J. Expression and characterization of HIV type 1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response. AIDS Res Hum Retroviruses. 15, 561-5670 (1999).
- Zhang, P. F., Bouma, P., Park, E. J. A variable region 3 (V3) mutation determines a global neutralization phenotype and CD4-independent infectivity of a human immunodeficiency virus type 1 envelope associated with a broadly cross-reactive, primary virus-neutralizing antibody response. J Virol. 76, 644-655 (2002).
