Summary
冠表面的HIV - 1包膜糖蛋白(gp120的)不同的V3的循环序列区域的结构特点,在许多情况下,在硅片的立场折叠10日至22日对一个国家的最先进的循环使用
Abstract
的HIV - 1的抗原多样性,长期以来一直是疫苗设计的障碍,而这种变化是,尤其是在病毒表面的包膜糖蛋白V3环明显。我们以前提出的V3环的冠,虽然动态和序列变量,是整个人口的HIV - 1病毒免疫相关的β-发夹高等教育结构的制约。重要的是,HIV - 1病毒在流传有成千上万不同的V3环冠序列,使得整个晶体或核磁共振困难或不可能的病毒多样性的趋势的三维结构表征。我们以前的1,2冠的V3折叠成功研究用从头算法3的ICM - Pro的分子建模软件包(Molsoft有限责任公司,拉霍亚,CA)的访问和建议,V3环的冠,专门从位置10至22,足够的灵活性和其侧翼茎长度的行为在很大程度上就好像它是一个不受约束的肽溶液中的折叠自由的好处。作为等,迅速AB只是这部分的任何个人的60000株的V3 环的从头折叠+循环HIV - 1毒株,可以翔实的。在这里,我们折叠的V3环的R2菌株,争取到其独特的性能结构基础的洞察力。 R2蕴藏着难得的V3环序列被认为是负责这株精湛的灵敏度,以中和病人血清和单克隆抗体,4, 5。应变介导CD4独立的感染和出现,引起广泛中和抗体。我们将演示如何评价结果的折叠可以在折叠与R2的观察免疫活动相关联的观察结构信息。
Protocol
1。方法
- 该协议的第一步是选择你想在硅片倍V3冠序列。对于R2菌株,该片段的序列是KSIPMGPGRAFYT。
- 这个序列的肽相应的三维原子结构应建立在计算机的虚拟空间。 ICM这个命令是:
buildpep“KSIPMGPGRAFYT”
或文件:新功能:可以选择下拉菜单下的肽 - 然后设置几个参数的过程,包括搜索步骤(搜索的长度),模拟温度,搜索策略参数,包括变量的约束,以实现合理的地区,能源条件,选择不同的能量计算方法偏见的搜索,应记录和参数说明如何搜索将被记录,例如是否记录电影,有多少中间得分的构象。所有这些参数进行了优化,由以前的出版物(见www.molsoft.com)。
- 折叠,然后用下面的命令启动:
蒙特卡洛
或文件:新的肽,可以选择下拉下拉菜单中的分子力学:最小化:全球
在前一种情况下,从第3步中的参数应设置在命令行之一。在后一种情况下,选择最常用的参数复选框窗格中提供的命令被执行之前。为方便起见,本实验利用的实验,并察看相同的折叠ICM的脚本如下所示:
这个脚本可以被保存在一个文本文件,并运行的计算机操作系统的命令行快速使用的命令(通常是LINUX的):
ICM _foldingscript
2。成功的秘诀
- V3环是一个常数35个氨基酸长度在几乎每一个著名的应变,所以氨基酸的位置编号从1到35,保税胱氨酸的原产二硫化碳1开始,并与相应的二硫化物保税在35胱氨酸终止。既然是一个循环的一部分,应慎重选择冠V3的界限。如果选择过大的一个片段,它是不太可能表现为一个自由灵活的部分,就好像它是一个自由肽,使折叠模拟,将无法正确评估的结构。如果选择太小的一个片段,翔实的三级结构可能不会在模拟的形式。我们以前的研究表明,从第10位22位的片段抗体绑定的晶体构象密切相关,所以应该选择折叠,这是任何V3环的片段。
- ,虽然使用的图形用户界面和下拉菜单是用户友好的,事先一般肽折叠的成功的工作,特别是使用ICM和V3环冠折叠使用上面的脚本,简单修改buildpep线的顺序和运行从上面的命令行脚本建议。
3。代表性的成果
R2的折叠的结果是代表任何V3环结果。要评估的结果,应打开和项目文件(它将被命名为“newProject1.icb”从上面的脚本)“分子力学,堆栈,查看”选择。会出现一个堆栈的构象表。栈构象可以通过点击“打印/直方图图标图形化显示。 “分子力学,栈,播放”将使堆栈的电影视觉欣赏发现折叠的构象喜好。对于R2的序列,构象是β-发夹状预计为V3的循环2 -尤其是在位置的片段12日至14一个明确的β链偏好是整个堆栈,和很少的α-螺旋构象被视为。此外,近3个单位的能源缺口之间的能量最低的构象和第二个最低能量构象。从一个充满活力的观点来看,这意味着只有闪烁的结构的最低能量构象不到一%的时间:折叠的结果,因此建议在R2 V3冠是一个刚性的,而不是灵活,结构。可能有其他重要的构象合奏结构特点,但它们很难系统地欣赏。
JRFL | SF162_V3JRFL | SF162_V3R2 | |
447 - 52D格林尼治标准时间50 | 15 | 0.00061 | 0.00078 |
表1:JRFL和R2 V3相对中立蒙面东窗事发设置循环。数据曾报道在卡多佐T., 等。ARHR(2008)和品特,A., 等。人研究Virol(2004年)。简单地说,中和活性测定一个单周期的传染性,使用的env缺陷的荧光素酶表达质粒JRFL环境保护或上文所述的SF162 V3的变种假型pNL4 - 3.Luc.RE产生psVs分析:SF162_V3JRFL包含JRFL V3 SF162 V3环序列进行循环序列。 SF162_V3R2包含R2 V3环序列在SF162 V3环序列的地方。 psVs孵育447 - 52D单克隆抗体系列稀释为1.5 h,在37 ° C,然后添加对CD4 + CCR5 + U87目标细胞在96孔板接种于聚凝胺(10毫克= ML)。 24小时后,细胞refed用RPMI含有10%FBS和10毫克= ML聚凝胺,一个额外的24-48 h孵化中期。测定荧光素酶的活性测定48-72 h,用一个微孔板光度计(HARTA公司)使用Promega公司,公司的几何平均滴度为50%的中(GMT50)检测试剂447 - 52D postinfection的中和曲线插值至少有三个独立实验的平均值。
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Discussion
从头计算折叠揭示了高等教育的结构特性,这可能不是研究单个氨基酸顺序明显的影响。 R2 V3环冠几个先前晦涩的结构特性,揭示折叠模拟。这些观察到的结构的偏好可能关联与观察到的功能特性R2的应变,即灵敏度,以中和hyperinfectivity 5。
首先,一个清晰的β链N -末端的立场12-14 R2 V3的冠一半的趋势是观察。这是R2的应变不寻常的异亮氨酸,脯氨酸-蛋氨酸(IPM)的序列位置。从447 - 52D的晶体结构,2219,Be48,2557,2558和537 - D抗- V3环抗体约束V3环肽,是12至14 V3环的约束,这些抗体,当绑定的立场,段采用本地的β链构象。从而表明,R2 V3环冠喜欢在阵地12日至14日是著名反V3环的中和抗体的互补构象折叠模拟。这种偏好可以解释观察到的这株的中和灵敏度。
其次,仿真结果表明3能量最低的构象和第二个最低能量构象之间的能量单位的差距,这表明刚性结构。 HIV - 1的gp120的是一个非常动态的分子,需要一个大的构象转变,从非绑定,免疫保护(unliganded)形式,其必然的人类受体和免疫暴露(liganded)的形式。的V3环的灵活性,可能会影响这种合作的过渡,刚性R2 V3环结构观察,这里可能抵制liganded形式转移,多为刚性块可能会更困难掖到一个狭小的空间相比,较软的柔性块。这种采用unliganded形式的阻力可能会暴露V3环,CD4结合位点和诱导中和抗原表位,所有这些都是典型的gp120的liganded形式暴露的CD4。因此,观察到的刚性,也可能在概念上连接的观察中和R2的应变灵敏度。
由于受体相互作用的V3环的形式的合作也可能会像中和抗体有针对性的形式的β-发夹,结果表明,共受体和中和抗体的补充形式,锁定R2 V3的冠反过来可以促进整个gp120的,成其liganded形式作出应变的高度传染性。因此,观察到的构象偏好和刚性也都可以在概念上与R2的hyperinfectivity关联。
V3环的一个刚性的,但暴露的共同受体和抗体互补的构象的这种安排是从一个灵活的,不同的的,但深埋或掩盖V3环,是典型的艾滋病毒菌株。折叠JRFL应变(展品的共识,B亚型HIV - 1 V3环序列),也显示了一个β链的偏好,但许多密切的最低能量构象暗示V3冠灵活性(数据未显示)。预测将V3环序列,这将是非常敏感,像447 - 52D相应的抗体中和,如果它被暴露,而不是埋。正如预期的那样,JRFL和R2序列是同样敏感,当暴露在嵌合SF162 pseudovirus V3环JRFL或R2 V3环(见表1)取代设置,但相同的JRFL V3环是完全不敏感失效时,其原生JRFL背景。
这些结果表明,R2的应变异常IPM序列赋予一个刚性的,抗体结合现场兼容,共同受体结合位点在V3环关键冠地区的兼容形状。刚性假设阻挠liganded和unliganded形式之间的转换gp120的构象的灵活性,它主要分为liganded形式的V3冠抗体最佳,共受体最佳形状是揭露和锁定。结果是到中和R2的应变hyperinfectivity的敏感性。这样一来, 从头折叠本议定书中所描述的实验是为艾滋病毒疫苗研究的信息:这里R2的观察折叠结果可能为HIV - 1疫苗的免疫原设计的重要,如何锁定成首选gp120的基础免疫原的线索,中敏感的构象。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持的比尔和梅林达盖茨基金会(#38631)和美国国立卫生研究院的资助,其中包括DP2 OD004631和R01 AI084119。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ICM-Pro | Molsoft LLC |
References
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