Summary
एचआईवी -1 की सतह लिफाफा glycoprotein (gp120) के विभिन्न V3 पाश दृश्यों का मुकुट क्षेत्र संरचनात्मक जा सकता है कई मामलों में सिलिको पदों की तह में विशेषता 10 से पाश की एक राज्य के-the-कला का उपयोग 22
Abstract
एचआईवी -1 के प्रतिजनी विविधता लंबे समय वैक्सीन डिजाइन के लिए एक बाधा किया गया है, और इस परिवर्तनशीलता 'वायरस की सतह लिफाफा glycoprotein V3 पाश में विशेष रूप से स्पष्ट है. हम पहले से प्रस्तावित है कि V3 पाश का मुकुट, हालांकि गतिशील और अनुक्रम चर, एचआईवी -1 वायरस के एक immunologically प्रासंगिक β सड़क के ढालवाँ तृतीयक संरचना जनसंख्या भर विवश है. महत्वपूर्ण बात है, वहाँ एचआईवी -1 वायरस परिसंचारी में अलग V3 पाश मुकुट दृश्यों के हजारों रहे हैं, मुश्किल या असंभव क्रि या एनएमआर द्वारा वायरस की विविधता भर में प्रवृत्तियों के 3D संरचनात्मक लक्षण वर्णन कर. हमारे V3 मुकुट 1, 2 की तह के साथ पिछले सफल अध्ययन अब initio 3 एल्गोरिथ्म ICM प्रो आणविक मॉडलिंग सॉफ्टवेयर पैकेज (Molsoft LLC, ला Jolla, CA) में पहुँचा इस्तेमाल किया और यह सुझाव दिया है कि V3 पाश के मुकुट से विशेष रूप से 10 से 22 पदों, लचीलापन और इसके flanking उपजी की लंबाई के लिए एक बड़ी डिग्री करने के लिए व्यवहार के रूप में अगर यह एक स्वेच्छापूर्ण स्वतंत्र रूप से समाधान में तह पेप्टाइड थे से पर्याप्त लाभ. +, जैसे सिर्फ 60,000 के किसी भी व्यक्ति के तनाव के V3 पाश के इस हिस्से के तेजी से अब initio तह के रूप में परिसंचारी एचआईवी -1 उपभेदों जानकारीपूर्ण किया जा सकता है. यहाँ, हम R2 के तनाव के V3 के पाश अपनी अद्वितीय गुण के संरचनात्मक आधार में जानकारी हासिल करने के लिए मुड़ा. R2 एक दुर्लभ V3 पाश इस तनाव के उत्तम रोगी सीरा और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 4, 5 के द्वारा निराकरण के लिए संवेदनशीलता के लिए जिम्मेदार होने लगा अनुक्रम भालू. सीडी 4 स्वतंत्र संक्रमण तनाव mediates और मोटे तौर पर उदासीन एंटीबॉडी बटोर प्रकट होता है. हम प्रदर्शन कैसे तह के परिणामों के मूल्यांकन तह में प्रतिरक्षाविज्ञानी R2 के लिए मनाया गतिविधियों के साथ मनाया संरचनाओं को जोड़ के लिए जानकारीपूर्ण किया जा सकता है.
Protocol
1. क्रियाविधि
- प्रोटोकॉल का पहला कदम V3 मुकुट अनुक्रम आप सिलिको में गुना करना चाहते हैं का चयन करें. R2 के तनाव के लिए, यह टुकड़ा के लिए अनुक्रम KSIPMGPGRAFYT है.
- इस क्रम को इसी पेप्टाइड 3D परमाणु संरचना कंप्यूटर के आभासी अंतरिक्ष में निर्मित किया जाना चाहिए. इस के लिए ICM आदेश है:
buildpep "KSIPMGPGRAFYT"
या फ़ाइल: नई पेप्टाइड: पुल डाउन मेनू के तहत चयनित किया जा सकता है है - प्रक्रिया के कई मापदंडों तो खोज चरणों की संख्या (खोज की लंबाई), अनुकार तापमान, खोज चर खोज पूर्वाग्रह की ओर उचित क्षेत्रों में, ऊर्जा शर्तों, विभिन्न ऊर्जा गणना के तरीकों का चयन करने के लिए मजबूरी सहित रणनीति मापदंडों सहित के सेट कर रहे हैं, और यह दर्शाता है कैसे खोज जैसे कि एक फिल्म रिकॉर्ड के लिए दर्ज हो जाएगा और कितने मध्यवर्ती स्कोरिंग रचना मापदंडों दर्ज किया जाना चाहिए. पिछले प्रकाशनों (www.molsoft.com देखें) द्वारा इन सभी मापदंडों को अनुकूलित किया गया है.
- तह तो कमांड के साथ शुरू की है:
मोंटेकार्लो
या फ़ाइल: नई पेप्टाइड मेनू आण्विक यांत्रिकी नीचे खींच के तहत चयनित किया जा सकता है: न्यूनतम: ग्लोबल
पूर्व मामले में, चरण 3 से पैरामीटर एक कमांड लाइन में सेट किया जाना चाहिए. उत्तरार्द्ध मामले में, सबसे अधिक चुना मापदंडों लिए चेक बॉक्स फलक में प्रदान की जाती हैं पहले आदेश मार डाला है. सुविधा के लिए एक ही तह ICM इस प्रयोग और पहले प्रकाशित प्रयोगों के लिए उपयोग स्क्रिप्ट यहाँ दिखाया गया है:
यह स्क्रिप्ट एक पाठ फ़ाइल में सहेजा जा सकता है है और कंप्यूटर ऑपरेटिंग सिस्टम कमांड लाइन (आमतौर पर लिनक्स) तेजी से आदेश का उपयोग से चलाने:
ICM _foldingscript
2. सफलता के लिए गोपनीयता
- V3 पाश एक निरंतर लंबाई में लगभग हर ज्ञात तनाव में 35 अमीनो एसिड है, तो एमिनो एसिड की स्थिति 1 से 35 तक गिने जा रहे हैं 1 उद्भव cystine बंधुआ डाइसल्फ़ाइड साथ शुरू करने और 35 में इसी cystine बंधुआ डाइसल्फ़ाइड के साथ समाप्त. चूंकि यह एक पाश का हिस्सा है, V3 के मुकुट की सीमाओं को ध्यान से चुना जाना चाहिए. यदि बहुत बड़ी एक टुकड़ा चुना है, यह संभावना नहीं है एक स्वतंत्र रूप से लचीला खंड के रूप में व्यवहार के रूप में अगर यह एक मुक्त पेप्टाइड थे, तो तह अनुकरण संरचना सही ढंग से नहीं आकलन करेंगे. यदि एक बहुत छोटा टुकड़ा चुना है, जानकारीपूर्ण तृतीयक संरचना अनुकार में फार्म नहीं हो सकता है. हमारे पूर्व अध्ययन से पता चला है कि 10 की स्थिति से 22 की स्थिति के लिए टुकड़ा प्रतिरक्षी बाध्य crystallographic रचना के साथ सहसंबद्ध है, तो यह किसी भी V3 पाश का टुकड़ा है कि तह के लिए चुना जाना चाहिए है.
- हालांकि ग्राफिकल यूजर इंटरफेस का उपयोग कर और पुल डाउन मेनू उपयोगकर्ता के अनुकूल है, सामान्य में पेप्टाइड तह पर पहले सफल काम में विशेष रूप से ICM और V3 पाश मुकुट तह का उपयोग कर के ऊपर स्क्रिप्ट प्रयोग किया जाता है, बस buildpep लाइन अनुक्रम में संशोधित करने और चलाने कमांड लाइन से ऊपर स्क्रिप्ट की सिफारिश की है.
3. प्रतिनिधि परिणाम
R2 मोड़ने के लिए परिणाम किसी भी V3 पाश के लिए परिणाम के प्रतिनिधि हैं. परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए, परियोजना फ़ाइल (यह ऊपर स्क्रिप्ट से "newProject1.icb" नाम दिया जाएगा) और खोला जाना चाहिए चुना "आण्विक यांत्रिकी, ढेर, देखें". ढेर रचना की एक तालिका दिखाई देगा. ढेर रचना प्लॉट / हिस्टोग्राम आइकन पर क्लिक करके रेखांकन कल्पना कर सकते हैं. "आण्विक यांत्रिकी, ढेर, चलायें" स्टैक की एक फिल्म बनाने के लिए नेत्रहीन गठनात्मक तह द्वारा खुला वरीयताओं की सराहना करेंगे. R2 के अनुक्रम के लिए, रचना है बीटा - सड़क के ढालवाँ तरह के रूप में V3 loops के लिए 2 की उम्मीद - पदों पर टुकड़ा में विशेष रूप से 12 से 14 जहां एक स्पष्ट वरीयता β भूग्रस्त ढेर भर में देखा जाता है, और बहुत कुछ अल्फा पेचदार रचना देखा. इसके अलावा, लगभग 3 इकाइयों के एक ऊर्जा अंतराल न्यूनतम ऊर्जा रचना और दूसरा सबसे कम ऊर्जा रचना के बीच देखा जाता है. को देखने के एक ऊर्जावान बिंदु से, इसका मतलब है कि संरचना सबसे कम ऊर्जा की रचना केवल समय का एक प्रतिशत से भी कम flickers तह परिणाम इसलिए सुझाव है कि R2 V3 मुकुट एक कठोर, बजाय लचीली संरचना, है. रचना के कलाकारों की टुकड़ी में अतिरिक्त महत्वपूर्ण संरचनात्मक सुविधाओं हो सकता है, लेकिन वे के लिए व्यवस्थित की सराहना करते हैं मुश्किल कर रहे हैं.
| JRFL | SF162_V3JRFL | SF162_V3R2 | |
| 447-52D GMT 50 | 15 | 0.००,०६१ | ०.०००७८ |
तालिका 1: JRFL और R2 V3 के सापेक्ष निराकरण नकाबपोश और बेपर्दा सेटिंग्स में छोरों. डेटा पहले Cardozo टी., एट अल ARHR (200 रिपोर्ट में किया गया था8) और पिंटर, ए, एट. अल जे Virol (2004). SF162_V3JRFL शामिल JRFL: संक्षेप में, को निष्क्रिय गतिविधि एक एकल चक्र संक्रामकता वातावरण दोषपूर्ण luciferase व्यक्त pNL4 3.Luc.RE प्लाज्मिड JRFL लि या SF162 V3 के ऊपर वर्णित वेरिएंट के साथ pseudotyped के साथ उत्पन्न psVs का उपयोग परख के साथ निर्धारित किया गया था V3 SF162 V3 पाश अनुक्रम की जगह में पाश अनुक्रम. SF162_V3R2 R2 V3 पाश अनुक्रम SF162 V3 पाश अनुक्रम की जगह में शामिल हैं. psVs 37 में 1.5 घंटे के लिए 447-52D MAB के धारावाहिक dilutions के साथ incubated रहे थे ° सी, और फिर सीडी 4 को जोडी CCR5 + U87 लक्ष्य कोशिकाओं polybrene (10 मिलीग्राम एमएल =) की उपस्थिति में 96 अच्छी तरह प्लेटों में चढ़ाया. 24 बजे के बाद, कोशिकाओं RPMI 10% FBS और 10 मिलीग्राम = एमएल polybrene, ऊष्मायन एक अतिरिक्त 24-48 घंटे से युक्त मध्यम के साथ refed थे. Luciferase गतिविधि एक microtiter प्लेट (HARTA इंक) 447 52D द्वारा luminometer Promega, इंक, ज्यामितीय मतलब titers से 50% (GMT50) निराकरण के लिए परख अभिकर्मकों का उपयोग के साथ 48-72 घंटे postinfection निराकरण घटता से प्रक्षेप द्वारा निर्धारित किया गया था निर्धारित किया गया है और कम से कम तीन स्वतंत्र assays के औसत हैं.
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Discussion
अब initio तह तृतीयक संरचनात्मक गुणों, प्रभाव जिसमें से व्यक्तिगत अमीनो एसिड को क्रमिक रूप से अध्ययन से स्पष्ट नहीं किया जा सकता है पता चलता है . R2 V3 पाश ताज के कई पहले अस्पष्ट संरचनात्मक गुणों तह अनुकरण द्वारा पता चला रहे हैं. इन मनाया संरचनात्मक वरीयताओं R2 के तनाव, अर्थात् निराकरण और hyperinfectivity 5 के लिए संवेदनशीलता का मनाया कार्यात्मक गुणों के साथ सहसंबंधी सकता है.
सबसे पहले, 12-14 पदों पर एन टर्मिनल R2 V3 मुकुट के आधे में एक स्पष्ट प्रवृत्ति β भूग्रस्त मनाया जाता है. इस R2 के तनाव असामान्य isoleucine प्रोलाइन - methionine अनुक्रम (आईपीएम) का स्थान है. 447-52D के crystallographic संरचनाओं, 2219, Be48, 2557, 2558 और 537 - डी विरोधी V3 पाश एंटीबॉडी V3 पाश पेप्टाइड्स पदों इन प्रतिपिण्डों द्वारा 12 से V3 पाश के 14 बाध्य कर रहे हैं, और, जब बाध्य करने के लिए बाध्य खंड एक स्थानीय β भूग्रस्त रचना को गोद ले. तह अनुकरण इस प्रकार से पता चलता है कि R2 V3 पाश मुकुट पदों पर 12 से 14 कि ज्ञात विरोधी V3 पाश एंटीबॉडी neutralizing के लिए पूरक है पर एक रचना पसंद है. यह वरीयता इस तनाव का निराकरण करने के लिए मनाया संवेदनशीलता को समझा जा सकता है.
दूसरे, अनुकार 3 न्यूनतम ऊर्जा रचना और दूसरा सबसे कम ऊर्जा रचना के बीच ऊर्जा इकाइयों के एक अंतर से पता चलता है, एक कठोर संरचना का सुझाव दे. एचआईवी -1 gp120 एक अत्यंत गतिशील अणु है, अपने अनबाउंड से एक बड़े गठनात्मक बदलाव, immunologically (unliganded) संरक्षित प्रपत्र अपने मानव बाध्य रिसेप्टर और immunologically उजागर फार्म (liganded) की आवश्यकता होती है. V3 पाश का लचीलापन इस सहकारी संक्रमण प्रभाव के लिए आवश्यक हो सकता है, और कठोर R2 V3 पाश संरचना यहाँ मनाया liganded फार्म से बाहर स्थानांतरण का विरोध हो सकता है, ज्यादा के रूप में एक कठोर ब्लॉक और अधिक कठिन हो सकता है एक छोटे से अंतरिक्ष में दूर की तुलना में टक सकता है एक नरम लचीला ब्लॉक. Unliganded फार्म अपनाने के लिए यह प्रतिरोध V3 पाश, सीडी 4 बाध्यकारी साइट और निराकरण epitopes, जो सभी के विशेषता gp120 के liganded रूप में उजागर कर रहे हैं प्रेरित सीडी 4 का पर्दाफाश हो सकता है. इस प्रकार, कठोरता मनाया भी अवधारणात्मक R2 के तनाव के मनाया निराकरण संवेदनशीलता के लिए हो सकता है जुड़ा होना.
चूंकि सह रिसेप्टर V3 लूप के फार्म बातचीत भी एंटीबॉडी neutralizing द्वारा लक्षित रूपों की तरह β-बाल के लिये कांटा होने की संभावना है, परिणाम बताते हैं कि R2 V3 सह रिसेप्टर और निष्क्रिय करने प्रतिरक्षी पूरक फार्म, ताज में बंद है जो बारी में अपने liganded प्रपत्र में पूरे gp120 को बढ़ावा देने, तनाव अत्यधिक संक्रामक बना सकते हैं. इस प्रकार, मनाया गठनात्मक वरीयता और कठोरता दोनों भी अवधारणात्मक R2 hyperinfectivity के साथ जुड़े किया जा सकता है.
एक कठोर, लेकिन उजागर सह रिसेप्टर और एंटीबॉडी V3 पाश के पूरक रचना की यह व्यवस्था है कि एक लचीला से अलग है, लेकिन दफन या नकाबपोश V3 पाश है कि एचआईवी उपभेदों के विशिष्ट है. JRFL तनाव (जो सर्वसम्मति subtype बी V3 एचआईवी -1 पाश अनुक्रम दर्शाती) की तह भी एक प्राथमिकता β भूग्रस्त, लेकिन बहुत बारीकी से वितरित सबसे कम ऊर्जा V3 मुकुट लचीलापन (नहीं दिखाया डेटा है) के विचारोत्तेजक रचना से पता चलता है. भविष्यवाणी की होगी कि इस V3 पाश अनुक्रम अत्यधिक 447-52D की तरह एक उचित एंटीबॉडी द्वारा निराकरण के प्रति संवेदनशील हो सकता है अगर यह के बजाय अवगत कराया गया दफन होगा. जैसी कि उम्मीद थी, JRFL और R2 के दृश्यों समान रूप से संवेदनशील हैं जब एक chimeric SF162 pseudovirus में जो V3 पाश JRFL या R2 V3 छोरों (1 टेबल) द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है के भीतर एक उजागर सेटिंग में प्रस्तुत, लेकिन एक ही JRFL V3 पाश पूरी तरह से असंवेदनशील है निराकरण करने के लिए जब अपने मूल JRFL संदर्भ में प्रस्तुत किया.
इन परिणामों का सुझाव है कि R2 के तनाव के असामान्य आईपीएम अनुक्रम एक कठोर, एंटीबॉडी बाध्यकारी साइट संगत, सह रिसेप्टर बाध्यकारी साइट V3 पाश के प्रमुख मुकुट क्षेत्र में संगत आकार प्रदान. कठोरता के लिए यह liganded और unliganded रूपों के बीच संक्रमण के रूप में gp120 के गठनात्मक लचीलापन में बाधा डालती धारणा है, यह अपने liganded फार्म जहां V3 ताज में एंटीबॉडी इष्टतम, सह रिसेप्टर इष्टतम आकार संपर्क में है और उपलब्ध है में काफी हद तक बंद है. परिणाम R2 के तनाव के निराकरण और hyperinfectivity संवेदनशीलता है. इस तरह, इस प्रोटोकॉल में वर्णित अब initio तह प्रयोग एचआईवी टीके के अनुसंधान के लिए जानकारीपूर्ण है: तह R2 के लिए यहाँ मनाया परिणाम पसंदीदा में gp120 आधारित immunogens लॉक करने के लिए एक सुराग के रूप में एचआईवी -1 वैक्सीन immunogen डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है संवेदनशील रचना निराकरण.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
काम OD004631 DP2 और AI084119 R01 सहित बिल और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन (# 38,631) और NIH से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICM-Pro | Molsoft LLC |
References
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- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop. AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).
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