Summary
सिंगल सेल विश्लेषण पौधे और पशु कोशिकाओं पर वायुमंडलीय दबाव में मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा एक तेज ऑप्टिकल फाइबर का उपयोग करने के लिए लेजर पृथक electrospray (LAESI) ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए कोशिकाओं का नमूना के द्वारा किया जाता है.
Abstract
एकल कोशिकाओं में जैव रसायनों का विश्लेषण सेल चयापचय, कोशिका चक्र, अनुकूलन, रोग राज्यों, आदि को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, यहां तक कि एक ही सेल प्रकार विषम जैव रासायनिक श्रृंगार उनकी शारीरिक स्थिति और पर्यावरण के साथ बातचीत के आधार पर प्रदर्शन. मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के परम्परागत तरीकों एकल कोशिकाओं में biomolecules के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल व्यापक नमूना तैयार करने पर भरोसा करते हैं. उनके प्राकृतिक वातावरण और व्यापक नमूना प्रसंस्करण से कोशिकाओं को हटाना सेलुलर संरचना में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व सकता है. परिवेश ionization तरीकों उनके पैतृक वातावरण में और व्यापक नमूना तैयारी के बिना नमूनों के विश्लेषण सक्षम के मध्य अवरक्त (मध्य IR) लेजर पृथक 2.94 सुक्ष्ममापी तरंग दैर्ध्य में जैविक सामग्री के आधार पर एक तकनीक पानी की अचानक उत्तेजना का उपयोग. कि चरण में परिणाम विस्फोट. 2 परिवेश ionization मध्य IR लेजर पृथक electrospray ionization (LAESI) और वायुमंडलीय दबाव अवरक्त मैट्रिक्स की मदद से desorption लेजर ionization (एपी आईआर - MALDI) के रूप में लेजर विकिरण, पर आधारित तकनीक, सफलतापूर्वक पानी के लिए सीधे - विश्लेषण करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है अमीर ऊतकों और वायुमंडलीय दबाव में biofluids 3-11 मध्य IR लेजर पृथक पंख है कि ज्यादातर उच्च चार्ज electrospray आयनों उत्पादन बूंदों के साथ नमूना coalesces से तटस्थ बात कण होते LAESI में. हाल ही में, एकल कक्षों के मध्य आईआर पृथक एक etched फाइबर के माध्यम से मध्य आईआर विकिरण देने के द्वारा किया गया था. इस पृथक से उत्पन्न पंख एक एकल कक्षों में LAESI एमएस द्वारा विविध चयापचयों का विश्लेषण सक्षम electrospray द्वारा postionized 12 यह लेख LAESI एमएस एकल कक्ष का उपयोग विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन. वीडियो प्रस्तुत एक Allium CEPA बल्ब की त्वचा से एक एकल epidermal सेल का विश्लेषण दर्शाता है. प्रणाली के योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है. एकल कक्ष और कक्ष से एक LAESI जन स्पेक्ट्रम पृथक का एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 2 में प्रदान की जाती हैं.
Protocol
1. ऑप्टिकल घटकों
- लेजर पृथक लेजर पृथक electrospray (LAESI) ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के लिए 2.94 सुक्ष्ममापी तरंग दैर्ध्य में 5 एनएस लेजर पल्स द्वारा निर्मित है. एक tunable ऑप्टिकल पैरामीट्रिक एक एन डी द्वारा संचालित थरथरानवाला: YAG लेजर (100 Opolette, Opotek इंक, Carlsbad, CA) के इस अध्ययन में पृथक के लिए प्रयोग किया जाता है. पुनरावृत्ति दर 5 और 100 हर्ट्ज के बीच चुना है. यह एक चतुर्थ श्रेणी के लेजर कि प्रत्यक्ष निवेश पर गंभीर आंख या त्वचा के लिए स्थायी क्षति का कारण हो सकता है. लेजर बीम की विसरित प्रतिबिंब भी त्वचा या आँख के लिए खतरनाक हो सकता है. सुरक्षा के लिए एक उपयुक्त लेजर आंख मारना पहनें.
- जर्मेनियम डाइऑक्साइड आधारित कांच के बने ऑप्टिकल फाइबर इन्फ्रारेड फाइबर सिस्टम, Inc (सिल्वर स्प्रिंग, एमडी) से प्राप्त हुई थी. यदि वहाँ Hytrel हैं और polyimide फाइबर पर कोटिंग्स दिशाओं छोर से उन्हें हटाने के नीचे का पालन करें. हीट 1 - मिथाइल-2-pyrrolidinone 130-150 डिग्री सेल्सियस धूआं हुड में. डुबकी फाइबर समाप्त होता है कि आप इस तरल में लगभग 1 मिनट के लिए या कोटिंग नरम करने के लिए शुरू होता है जब तक और दूर छील पट्टी करना चाहते हैं. मेथनॉल या एक मिनट के लिए isopropanol में नरम कोटिंग डुबकी, और एक प्रकार का वृक्ष मुक्त नैपकिन के साथ किसी भी शेष कोटिंग पोंछ. कोटिंग हटाने के बाद, फोड़ना स्कोरिंग और धीरे से उन्हें तड़क द्वारा एक नीलमणि ब्लेड (KITCO फाइबर ऑप्टिक्स, वर्जीनिया Beach, VA) के साथ फाइबर के दोनों सिरों.
- वांछित तीखेपन को प्राप्त करने के लिए, 1% (v / v) नाइट्रिक एसिड (अभिकर्मक ग्रेड) समाधान द्वारा रासायनिक फाइबर टिप के खोदना एक छोर. लंबबत चयनित प्रारंभिक संपर्क के बाद 300 से 500 सुक्ष्ममापी की गहराई के लिए एसिड समाधान में फाइबर के अंत विसर्जित कर दिया. नक़्क़ाशी के लगभग 15 मिनट के बाद, टिप अनायास एसिड की सतह से अलग होगा. तेज ~ 15 सुक्ष्ममापी त्रिज्या की वक्रता के साथ फाइबर टिप में यह परिणाम है. विआयनीकृत पानी से कुल्ला करने के लिए किसी भी एसिड अवशेषों को हटाने के लिए.
- माउंट micromanipulator पर फाइबर (MN-151, Narishige, टोक्यो, जापान) के etched अंत और इसे लाने के लिए ऊर्जा कुशल बयान के लिए कोशिका की सतह की निकटता (~ 20 सुक्ष्ममापी) बंद.
- गैर etched एक नंगे फाइबर चक (BFC300, Siskiyou निगम, अनुदान पास, या) द्वारा ऑप्टिकल फाइबर के अंत पकड़ो. ऑप्टिकल संरेखण के लिए, फाइबर चक पांच अक्ष एक अनुवादक (BFT-5, Siskiyou निगम, अनुदान पास, या) पर मुहिम शुरू की है. लेजर ऊर्जा (0.5 करने के लिए 1 MJ) फाइबर में एक Plano-उत्तल कैल्शियम फ्लोराइड या अपने गैर etched अंत पर antireflection लेपित ZnSe लेंस (इन्फ्रारेड ऑप्टिकल उत्पाद, Farmingdale, एनवाई) द्वारा बीम ध्यान केंद्रित द्वारा युग्मित है. संरक्षित सोने दर्पण (PF10-03-M01, Thorlabs, न्यूटन, न्यू जर्सी) के लेंस पर ध्यान केंद्रित मध्य IR लेजर बीम बधिया किया जाता है.
2. Electrospray सेटअप
- धातु संघ, प्रवाहकीय perfluoroelastomer सामी, फिटिंग, टयूबिंग आस्तीन, सुई बंदरगाह (उदाहरण के लिए, U-435, M215, एफ 331Nx, एफ 242x, 9013, क्रमशः IDEX स्वास्थ्य और विज्ञान के साथ: electrospray निम्नलिखित घटकों का उपयोग कर प्रणाली का निर्माण किया जा सकता है ओक हार्बर, WA) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जुड़े सिलिका टयूबिंग (जैसे, CT360-100-50-5, नई उद्देश्य इंक, Woburn, एमए). सिफारिश emitter स्टेनलेस स्टील से बना है और एक 50 सुक्ष्ममापी आईडी (जैसे, MT320-50-5-5, नई उद्देश्य इंक, Woburn, एमए) के साथ एक पतला टिप है.
- 0.1% electrospray के लिए एसिटिक एसिड (v / v) के साथ 50% मेथनॉल समाधान तैयार करें. समाधान एक सिरिंज पंप (हार्वर्ड उपकरण, Holliston, एमए) से 200 से 300 nl / मिनट की दर से पंप का उपयोग कर, उदाहरण के लिए, एक 500 μl सिरिंज (81,222, हैमिल्टन कंपनी, Reno, NV).
- धातु संघ के लिए एक विनियमित बिजली की आपूर्ति (PS350, स्टैनफोर्ड अनुसंधान सिस्टम्स इंक, Sunnyvale, सीए) के लिए एक स्थिर electrospray उत्पन्न द्वारा २८०० और +३,००० वी के बीच उच्च वोल्टेज लागू करें. सुनिश्चित करें कि सभी बिजली कनेक्शन सुरक्षित और ठीक से जमीन परिरक्षण के साथ परिरक्षित हैं. उजागर उच्च वोल्टेज के साथ सीधे संपर्क बिजली के झटके में परिणाम कर सकते हैं.
3. नमूना हैंडलिंग
- रहते हैं या एक उपयुक्त स्रोत से सेल नमूना ऊतक प्राप्त करने और रखने के रूप में उन्हें विश्लेषण से पहले की सिफारिश की. इस प्रदर्शन के लिए Allium CEPA बल्ब एक स्थानीय दुकान से खरीदे गए थे . एक शल्य चिकित्सा स्केलपेल द्वारा एक बल्ब longitudinally कट. पैमाने के कुछ सेंटीमीटर खंड एक पट्टी में sectioned था. भीतर epidermal ऊतक के एक बरकरार monolayer से खुली है.
- epidermis की गीली सतह एक पूर्व - साफ कांच खुर्दबीन स्लाइड पर ऊतक माउंट करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक सामान्य प्रयोजन प्लेट (FP01, Thorlabs इंक, न्यूटन, न्यू जर्सी) धारक स्थिति के लिए एक तीन अक्ष अनुवाद मंच पर घुड़सवार द्वारा स्लाइड पकड़ो. नमूना बढ़ते सेल गिरावट को रोकने के बाद तुरंत जन स्पेक्ट्रा मोल.
4. विज़ुअलाइज़ेशन सिस्टम
- दो लंबी दूरी सूक्ष्मदर्शी के विश्लेषण के लिए कक्षों का चयन करें और तेज फाइबर टिप और कोशिका की सतह के बीच की दूरी बनाए रखने के उपयोग किया जाता है. बाद 15 ° -30 ° सतह से मापा कोण के तहत मुहिम शुरू की है. इस प्रणाली के लिए अल से मिलकर बनता हैएक 5x अनंत के साथ ong दूरी वीडियो खुर्दबीन (सटीक 7x ज़ूम ऑप्टिक, एडमंड प्रकाशिकी, Barrington, न्यू जर्सी) सीसीडी कैमरा (F131 मार्लिन, मित्र विजन टेक्नोलॉजीज के साथ सुसज्जित उद्देश्य लेंस (एम योजना ए पी ओ 5x, MITUTOYO कं, Kanagawa, जापान) को सही Stadtroda, जर्मनी) निगरानी और छवि पर कब्जा के लिए.
- दूसरा वीडियो खुर्दबीन नमूना की सतह के लिए एक सही कोण पर मुहिम शुरू की है करने के लिए ऊपर से कोशिकाओं की कल्पना कर सकते हैं. इस प्रणाली दृश्य प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए पृथक और विश्लेषण के लिए चयनित कक्ष पर फाइबर टिप संरेखित. यह एक सटीक 7x ज़ूम ऑप्टिक (एडमंड प्रकाशिकी, Barrington, न्यू जर्सी), एक 10x अनंत के साथ फिट होते हैं लंबे समय तक काम दूरी उद्देश्य (एम योजना ए पी ओ 10x, MITUTOYO कं, Kanagawa, जापान) लेंस और एक सीसीडी कैमरा सही.
5. मास स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण
- लेजर, electrospray और मास स्पेक्ट्रोमीटर, जैसे, एक quadrupole प्रणाली समय की उड़ान (Q-TOF प्रीमियर वाटर्स, Milford, एमए) पर मुड़ें. पृथक हाजिर और electrospray एक दूसरे के सापेक्ष emitter और मास स्पेक्ट्रोमीटर के छिद्र अधिकतम आयन तीव्रता प्राप्त करने की स्थिति का समायोजन करके LAESI आयन स्रोत की ज्यामिति का अनुकूलन.
- दृश्य शीर्ष - दृश्य प्रणाली का उपयोग करके विश्लेषण के लिए ब्याज की कक्ष का चयन करें. चयन के बाद, नमूना मंच को स्थानांतरित करने के लिए ऑप्टिकल फाइबर की तेज टिप के नीचे सीधे चयनित कक्ष लाने. ओर देखने माइक्रोस्कोप का उपयोग टिप कोशिका की सतह ~~ 20 सुक्ष्ममापी दूरी रद्दोबदल.
- आग etched फाइबर टिप के माध्यम से चयनित कक्ष में लेजर दालों. बात कण के रूप में cytoplasm कोशिका दीवार और इंजेक्शन के वेध में यह परिणाम है. Electrospray द्वारा postionization के बाद, उत्पादन आयनों मास स्पेक्ट्रोमीटर और जन स्पेक्ट्रा एकत्र कर रहे हैं दर्ज हैं.
- डाटा अधिग्रहण के बाद, लेजर, electrospray और standby मोड में मास स्पेक्ट्रोमीटर डाल या उन्हें बंद. Ablated ए रखें CEPA प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा वैकल्पिक अवलोकन के लिए ऊतक का नमूना.
6. प्रतिनिधि परिणाम
कोशिका दीवार और एक LAESI व्यापक स्पेक्ट्रम के संग्रह के फोड़ में एक एकल कोशिका के परिणामों के सफल पृथक. एक असफल प्रयोग आम तौर पर कोई पृथक और / या कोई जन स्पेक्ट्रम में परिणाम है. प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए, हम एक एकल एम्बेडेड एक ए के epidermal सेल के LAESI एमएस विश्लेषण से परिणाम प्रस्तुत CEPA बल्ब. चित्रा 2a एक सेल के नमूने के बाद एक प्रतिनिधि ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी छवि से पता चलता है. कोशिका दीवार छिद्रित है और वेध की हद तक पड़ोसी की कोशिकाओं के साथ सीमाओं द्वारा सीमित है. सन्निकट कक्षों को बरकरार लग रहे हो. चित्रा 2b एक प्रतिनिधि LAESI जन सेल से उत्पादित स्पेक्ट्रम से पता चलता है. आयनों की एक विस्तृत विविधता ए से पता चला रहे हैं CEPA सेल और उनके सटीक जनता पर आधारित है, आइसोटोप वितरण पैटर्न, और कुछ मामलों में, अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रा, वे अंतरिम रूप से अंतर्जात चयापचयों को सौंपा जाता है. किसी एकल कक्ष से पता चला आयनों एकाधिक कोशिकाओं के पारंपरिक LAESI - एमएस द्वारा एक ही ऊतक के विश्लेषण में मनाया लोगों को समान थे 13 .
चित्रा 1. LAESI एमएस द्वारा एकल कक्ष विश्लेषण के योजनाबद्ध. मध्य IR लेजर पल्स एक ऑप्टिकल फाइबर में युग्मित है और गिलास स्लाइड पर रखा नमूना दिया. तेज फाइबर टिप लक्ष्य कक्ष में प्रकाश ध्यान केंद्रित है और जमा ऊर्जा सेल फटना. उत्पादन पृथक पंख (लाल डॉट्स) एक electrospray पंख (काले डॉट्स) (हरी डॉट्स) बूंदों संगठित होना नमूना विशिष्ट आयन उत्पादन में जिसके परिणामस्वरूप के साथ विलय कर दिया है. इन आयनों का विश्लेषण कर रहे हैं और मास स्पेक्ट्रोमीटर (एमएस) के द्वारा पता लगाया है. दो लंबी दूरी वीडियो सूक्ष्मदर्शी, 1 माइक्रोस्कोप और दो माइक्रोस्कोप, फाइबर टिप और कोशिका की सतह के बीच की दूरी की निगरानी और विश्लेषण के लिए एक सेल, क्रमशः का चयन करने के लिए उपयोग कर रहे हैं.
चित्रा 2a एक ए के एक एकल epidermal सेल पर निशान एबलेशन. CEPA बल्ब. सन्निकट कक्षों दिखाई नुकसान प्रदर्शन नहीं करते हैं और बाद में अलग से विश्लेषण किया जा सकता है.
चित्रा 2b मास एक एकल ए पृथक करने के लिए इसी स्पेक्ट्रम CEPA epidermal सेल प्राथमिक और माध्यमिक चयापचयों का मौजूदगी से पता चलता है.
Discussion
cytoplasm कोशिका और कोशिका दीवार या झिल्ली के तन्य शक्ति के पानी की सामग्री LAESI एमएस विश्लेषण के दौरान एकल कक्षों के पृथक गवर्निंग महत्वपूर्ण कारक हैं. लेजर प्रभाव के लिए अलग सेल प्रकार के पृथक थ्रेसहोल्ड तक पहुँचने के लिए समायोजित किया जा है. वितरित प्रभाव लेजर लेजर पल्स की ऊर्जा और फाइबर टिप और कोशिका की सतह के बीच की दूरी पर निर्भर करता है. एकल कक्ष विश्लेषण के दौरान पड़ोसी कोशिकाओं की बेचैनी कम से कम महत्वपूर्ण है. पृथक दहलीज पर लेजर ऊर्जा को ध्यान में रखते हुए सन्निकट कक्षों पर विश्लेषण के प्रभाव को सीमित करता है.
रासायनिक इमेजिंग के लिए प्राकृतिक बड़ा (voxels) एमएस द्वारा पिक्सल के रूप में संभावित अनुप्रयोगों के एकल कक्षों का उपयोग कर रहा है. एक कृत्रिम अक्सर आयताकार ग्रिड पर डाटा एकत्रित करने के लिए तुलना में, एक ऊतक एक कक्ष एक समय में रासायनिक इमेजिंग अधिक कोशिकाओं के बीच जैव रासायनिक बातचीत के स्थानिक संगठन बनाए रखने होने की संभावना है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों निम्नलिखित संस्थाओं द्वारा वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (0719232 अनुदान), ऊर्जा विभाग (अनुदान DEFG02 - 01ER15129), WM उबकना फाउंडेशन (041,904 अनुदान), और जॉर्ज वॉशिंगटन विश्वविद्यालय के अनुसंधान संवर्धन फंड. लेखकों GeO2 आधारित ऑप्टिकल फाइबर के लिए उदारता मार्क ई. Reeves और जॉर्ज वॉशिंगटन के Joan ए Hoffmann द्वारा फाइबर नक़्क़ाशी के बारे में प्रोटोकॉल पर प्रारंभिक चर्चा के लिए इन्फ्रारेड फाइबर (सिल्वर स्प्रिंग, एमडी) सिस्टम के रूप में के रूप में अच्छी तरह के द्वारा आपूर्ति की आभारी हैं विश्वविद्यालय. लेखकों को भी उसकी मदद करने के लिए प्रोटोकॉल के वीडियोटैपिंग दौरान जेसिका ए Stolee धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Fluka | 45727 | |
| Methanol | Fluka | 65548 | |
| 1-methyl-2-pyrrolidinon | Sigma-Aldrich | M79603 | |
| Water | Fluka | 39259 |
References
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