大気圧質量分析法による単一細胞の直接分析

Summary

単一細胞解析は、レーザーアブレーションのエレクトロスプレーイオン化（LAESI）質量分析のために細胞をサンプリングするために削られた光ファイバを使用して、大気圧下で植物や動物の細胞に質量分析法によって行われます。

Abstract

単一細胞内の生化学物質の分析でも同じ種類の細胞がそれらの生理的条件と環境との相互作用に応じて、異種の生化学的メイクを示す細胞の代謝、細胞周期、適応、疾患の状態などを理解する上で重要です。単一細胞内の生体分子の解析に用いる質量分析（MS）の従来の方法には、豊富なサンプル調製に依存しています。彼らの自然環境と豊富なサンプルの処理から細胞を除去する細胞組成の変化につながる可能性があります。周囲のイオン化法は、ネイティブ環境では、広範な試料調製のないサンプルの分析が可能になります^。1は 2.94μmの波長の生物学的材料の中間赤外（中赤外）レーザーアブレーションに基づく技術は、水の突然の励起を利用するその段階での結果爆発。このようなレーザーアブレーションエレクトロスプレーイオン化（LAESI）と大気圧赤外線マトリックス支援レーザー脱離イオン化（AP IR - MALDI）などの中赤外レーザーの照射に基づいて²周囲イオン化技術は、正常に直接水を分析する能力を実証した大気圧下で豊富な組織や体液。LAESI主にイオンを生成するために高度に帯電したエレクトロスプレー液滴と試料の合体から中性の粒子状物質で構成されて中赤外レーザーアブレーションプルーム中の^3-11。最近、単一の細胞の中赤外アブレーションは、エッチングされた光ファイバを介して中赤外放射を提供することにより行った。このアブレーションから生成されるプルームはLAESI - MSによる単一細胞の多様な代謝物の分析を可能にするエレクトロスプレーによってpostionizedした^。12この記事は、LAESI - MSを用いて単一細胞解析のための詳細なプロトコルを記述している。紹介ビデオは、 タマネギの球の皮膚から単表皮細胞の分析を示しています。システムの概略図を図1に示されています。細胞から単一細胞のアブレーションとLAESIのマススペクトルの代表例を図2に提供されています。

Protocol

1。光学部品

1. レーザーアブレーションのエレクトロスプレーイオン化（LAESI）質量分析（MS）のためのレーザーアブレーションは、2.94μmの波長の5ナノ秒レーザーパルスによって生成されます。ネオジムで駆動される可変光パラメトリック発振器：YAGレーザー（Opolette 100、Opotek社、カールスバッド、カリフォルニア州）はこの研究ではアブレーションのために使用されます。繰返し速度は5〜100 Hzの間で選択されています。これは直接の暴露による眼や皮膚に深刻な永久的な損傷を引き起こす可能性があることをクラスIVのレーザーです。レーザービームの乱反射はまた、皮膚や眼に対して危険です。保護のための適切なレーザーのゴーグルを着用してください。
2. 二酸化ゲルマニウムベースのガラス製の光ファイバは、赤外ファイバーシステムズ社（シルバースプリング、MD）から入手した。そこハイトレルであり、繊維のコーティングをポリイミド場合両端からそれらを削除するには、次の指示に従ってください。 ° Cドラフト内で130から150までヒート1 - メチル-2 - ピロリジノン。繊維は、約1分間、またはコーティングの軟化を開始し、剥離するまでこの液体に削除するようにしたい終わる浸します。分のためのメタノールまたはイソプロパノールに軟化コーティングを浸し、糸くずの出ないナプキンと残りのコーティングを拭き取ってください。コー​​ティングを除去した後、切断するスコアリングと優しくして洗浄液を完全にサファイアブレード（KITCOファイバーオプティクス、バージニアビーチ、バージニア州）と光ファイバの両端。
3. 1％（v / v）の硝酸（試薬特級）ソリューションによって、繊維の先端の化学的エッチング一方の端を目的のシャープネスを実現する。垂直に最初の接触後、300〜500μmの深さに酸溶液中に繊維の選択終了を浸す。エッチングの約15分後、先端には、自発的に酸の表面から分離させます。曲率の​​〜15μmの半径を持つ尖った繊維の先端でこの結果。任意の酸残基を除去する脱イオン水ですすいでください。
4. マイクロマニピュレータの光ファイバ（MN - 151、成茂、東京、日本）のエッチング端をマウントし、効率的なエネルギー付与のために細胞表面の近接（〜20μm）を閉じるためにそれをもたらす。
5. ベアファイバチャック（BFC300、シスキユーコーポレーション、グランツパス、OR）によって光ファイバの非エッチング端を保持する。光学的アラインメントの場合は、ファイバーチャックは5軸トランスレータ（BFT - 5、シスキユーコーポレーション、グランツパス、OR）にマウントされています。レーザーのエネルギー（0.5〜1 MJ）は、その非エッチングエンドに平凸フッ化カルシウムまたは反射防止コーティングのZnSeレンズ（赤外線光学製品、ファーミングデール、ニューヨーク州）でビームを集中させ繊維に結合される。保護された金の鏡（PF10 - 03 - M01、Thorlabs、ニュートン、ニュージャージー州）は、集光レンズの上に中赤外レーザビームを操縦するために使用されます。

2。エレクトロスプレーセットアップ

1. 導電性パーフロロエラストマーフェラル、フィッティング、チューブスリーブ、ニードルポート（それぞれ例えば、U - 435、M215、F - 331Nx、F - 242x、9013、IDEX健康科学、と金属労働組合：エレクトロスプレーシステムは、次のコンポーネントを使用して構築することができます。オークハーバー、ワシントン州）だけでなく、フューズドシリカチューブ（例えば、CT360 - 100 - 50 - 5、新しい目的（株）、ウォーバーン、マサチューセッツ州）。推奨エミッタはステンレス鋼製で、50μmのID（例えば、MT320 - 50 - 5 - 5、新しい目的（株）、ウォーバーン、マサチューセッツ州）とテーパー先端部を有している。
2. エレクトロのための0.1％酢酸（v / v）で50％メタノール溶液を調製。ソリューションを使用して、シリンジポンプ（ハーバード装置、ホリストン、MA）で200〜300 NL / minの速度で励起され、例えば、500μLシリンジ（81222、ハミルトン社、リノ、ネバダ州）。
3. 安定したエレクトロスプレーを生成するために安定化電源（PS350、スタンフォードリサーチシステムズ社、カリフォルニア州サニーベール）によって金属の組合に2800と3,000 Vの間に高電圧を印加してください。すべての電気接続が確実、適切に接地されたシールドでシールドしていることを確認してください。露出の高電圧との直接接触は感電の恐れがあります。

3。サンプル処理

1. 適切なソースから生きている組織または細胞のサンプルを入手し、それらを分析する前に推奨してください。このデモ用のタマネギの球根は、ローカルストアから購入した。外科用メスで縦方向に電球をカット。規模の少数のセンチメートルのセグメントは、ストリップに区分した。内側の表皮組織の完全な単分子膜を剥離する。
2. 表皮の湿った表面は、事前に洗浄したガラスの顕微鏡スライド上の組織をマウントするために使用されます。位置決め用の三軸移動ステージにマウントされている汎用のプレートホルダー（FP01、Thorlabs社、ニュートン、ニュージャージー州）でスライドをホールド。セルの劣化を防止するためにサンプルをマウントした直後にマススペクトルを取得する。

4。可視化システム

1. 二つの長距離顕微鏡は、分析用のセルを選択すると尖った繊維の先端と細胞表面との間の距離を維持するために使用されています。後者は表面から測定した15 ° -30 °の角度でマウントされています。このシステムは、らで構成されています5倍の無限大とオングの距離のビデオ顕微鏡（7倍精度ズーム光学、エドモンドオプティクス、バーリントン、NJ）は、CCDカメラ（マーリンF131、アライドビジョンテクノロジーを搭載した、対物レンズ（Mプランアポ5倍、ミツトヨ（株）、神奈川県、日本）を修正監視および画像取り込みのための、Stadtroda、ドイツ）。
2. 秒のビデオ顕微鏡は、上から細胞を可視化するために試料表面に直角に取り付けられている。このシステムは、アブレーションおよび分析のために選択したセルの上のファイバーの先端を揃えるために視覚的なフィードバックを提供します。それは10倍の無限大を搭載した7倍の精度ズーム光学（エドモンドオプティクス、バーリントン、NJ）から成り、長作動距離対物レンズ（10倍Mプランアポ、ミツトヨ（株）、神奈川県、日本）とCCDカメラを訂正。

5。マススペクトルの取得

1. レーザー、エレクトロスプレー質量分析計、例えば、四重極飛行時間型システム（Q - TOFプレミア、ウォーターズ、ミルフォード、マサチューセッツ州）をオンにします。アブレーションのスポットやエレクトロ互いに相対的なエミッタと最大イオン強度を達成するために質量分析計のオリフィスの位置を調整することによって、LAESIのイオン源の形状を最適化します。
2. トップビューの可視化システムを使用して分析の対象セルを選択します。選択後、直接光ファイバの先鋭化先端下に選択したセルを持って来るために、サンプルステージを移動します。サイドビュー顕微鏡を使用すると、〜20μmの先端から細胞表面の距離を再調整。
3. エッチングされた光ファイバ先端を介して選択されたセルでの火災のレーザーパルスを。細胞壁と粒子状物質の形で細胞質の放出の穿孔でこの結果。エレクトロスプレーによるpostionizationした後、生成したイオンは質量分析計と質量スペクトルによって収集され記録されます。
4. データ収集後は、レーザー、スタンバイモードのエレクトロと質量分析計を入れたり、それらの電源を切ります。アブレーションA.キープ光顕微鏡によるオプションの観察のためのCEPAの組織サンプル。

6。代表的な結果

細胞壁とLAESIの質量スペクトルのコレクションの崩壊で、単一セルの結果の成功アブレーション。失敗した実験は、通常、無アブレーションおよび/または無質量スペクトルをもたらす。デモンストレーションの目的のために、我々はAの単一の埋め込 ​​まれた表皮細胞のLAESI - MS分析の結果を提示CEPAの電球。図2aは、細胞の採取後の代表的な光学顕微鏡像を示しています。細胞壁は、ミシン目が入っていますし、穿孔の程度は、隣接セルとの境界によって制限されます。隣接する細胞が正常であるように思われる。図2bは、細胞から産生さ代表LAESIの質量スペクトルを示しています。イオンの多種多様なAから検出されCEPAのセルとその正確な質量に基づいて、同位体の分布パターン、及び、いくつかのケースでは、タンデム質量スペクトル、それらは暫定的に内因性代謝物に割り当てられます。単一の細胞から検出されたイオンは、複数のセルの従来のLAESI - MSで同じ組織の分析で観察されたものと類似していた^。13

図1。 LAESI - MSによる単一細胞解析の概略図 。中赤外レーザーパルスが光ファイバに結合し、ガラススライド上に配置サンプルに配信されます。尖った繊維の先端は、標的細胞に光を当てて堆積したエネルギーは、セルを爆発。生成されたアブレーションプルーム（赤い点）は液滴が合体するエレクトロスプレープルーム（黒ドット）（緑の点）のサンプル、特定のイオン生成の結果とマージされます。これらのイオンは、質量分析計（MS）により分析し、検出されます。二つの長距離ビデオマイクロスコープ、顕微鏡1、顕微鏡2は、繊維の先端と細胞表面との間の距離を監視し、それぞれ、分析のためのセルを選択するために利用されています。

A.単一の表皮細胞上図2a。アブレーションマークCEPAの電球。隣接するセルは、目に見える損傷を示していないと、その後別々に分析することができます。

シングルAのアブレーションに対応する図2b。質量スペクトルCEPA表皮細胞は一次と二次代謝産物の存在を示しています。

Discussion

細胞の細胞質と細胞壁や細胞膜の引張強度の含​​水量はLAESI - MS分析時の単一細胞のアブレーションを支配する重要な要素です。レーザーのフルエンスは、異なる細胞型のアブレーションしきい値に達するように調整する必要があります。納入レーザフルエンスは、レーザーパルスのエネルギーにし、繊維の先端と細胞表面との間の距離に依存する。単一細胞解析の間に隣接するセルの摂動を最小化することが重要です。アブレーションしきい値でレーザーのエネルギーを保つことは、隣接するセルに分析の影響を制限します。

潜在的なアプリケーションの一つは、MSによる化学イメージングのための自然な体積画素（ボクセル）として単一のセルを使用しています。人工しばしば長方形のグリッド上でデータを収集して比較して、一度に組織つのセルの化学イメージングは​​、細胞間の生化学的相互作用の空間的な組織を維持する可能性が高くなります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Fluka	45727
Methanol	Fluka	65548
1-methyl-2-pyrrolidinon	Sigma-Aldrich	M79603
Water	Fluka	39259