Summary
Análisis de las células individuales se realiza por espectrometría de masas en las células animales y vegetales a la presión atmosférica mediante el uso de una fibra óptica para afilado de la muestra de las células de ionización electrospray ablación con láser (LAESI) espectrometría de masas.
Abstract
Análisis de productos bioquímicos en las células individuales es importante para entender el metabolismo celular, ciclo celular, la adaptación, los estados de enfermedad, etc Incluso los mismos tipos de células presentan distribución heterogénea bioquímicos en función de sus condiciones fisiológicas y la interacción con el medio ambiente. Los métodos convencionales de espectrometría de masas (MS) que se utiliza para el análisis de biomoléculas en células individuales se basan en la preparación de muestras amplias. La eliminación de las células de su entorno natural y de procesamiento de muestras extensas podría conducir a cambios en la composición celular. Métodos de ionización ambiental permitirá el análisis de muestras en su medio ambiente y sin preparación de la muestra amplia. 1 Las técnicas basadas en el infrarrojo medio (infrarrojo medio), la ablación por láser de materiales biológicos en longitud de onda de 2,94 micras utilizan la excitación repentina de agua que los resultados en la fase explosión. 2 técnicas de ionización ambiental sobre la base de la radiación láser infrarrojo medio, como la ionización electrospray ablación con láser (LAESI) y la presión atmosférica de infrarrojos láser asistida por matriz de ionización de desorción (AP-MALDI IR), han demostrado con éxito la capacidad de analizar directamente el agua tejidos ricos y biofluidos a presión atmosférica. 3-11 En LAESI la pluma láser infrarrojo medio de ablación que se compone principalmente de partículas neutrales de la muestra se funde con las gotas de electrospray muy cargado para producir iones. Recientemente, a mediados de IR ablación de las células individuales se realizó mediante la entrega de la radiación de infrarrojo medio a través de una fibra de grabado. La columna de humo generada a partir de esta ablación fue postionized por un electrospray permitiendo el análisis de metabolitos diferentes en las células individuales por LAESI MS-12. En este artículo se describe el protocolo detallado para el análisis de células individuales con LAESI-MS. El video presentado demuestra el análisis de una única célula epidérmica de la piel de un bulbo de Allium cepa. El esquema del sistema se muestra en la Figura 1. Un ejemplo representativo de la ablación de células individuales y un espectro de masas LAESI de la célula se proporcionan en la Figura 2.
Protocol
1. Los componentes ópticos
- La ablación con láser de ionización electrospray ablación con láser (LAESI) espectrometría de masas (MS) es producido por un pulso de 5 ns láser de longitud de onda en micras 2,94. Un oscilador óptico paramétrico sintonizable impulsado por un láser Nd: YAG (Opolette 100, Opotek Inc., Carlsbad, CA) se utiliza para la ablación en este estudio. La tasa de repetición se selecciona de entre 5 y 100 Hz. Este es un láser de clase IV, que la exposición directa puede causar graves daños permanentes a los ojos o la piel. La reflexión difusa del haz de láser también puede ser peligroso para la piel o los ojos. Usar un láser gafas adecuadas para su protección.
- La fibra óptica de vidrio basados en dióxido de germanio se obtuvo a partir de infrarrojos Fiber Systems, Inc. (Silver Spring, MD). Si hay Hytrel y revestimientos de poliamida en la fibra siga las siguientes instrucciones para eliminar de los extremos. Calentar 1-metil-2-pirrolidona a 130-150 ° C bajo una campana extractora. Sumerja la fibra de los extremos que se quieren eliminar a este líquido durante aproximadamente 1 minuto o hasta que el recubrimiento comienza a ablandar y despegar. Sumerja la capa blanda en metanol o isopropanol por un minuto, y limpie el recubrimiento sobrante con una toalla sin pelusa. Después de retirar el recubrimiento, unirá los dos extremos de la fibra con una hoja de zafiro (Kitco fibra óptica, Virginia Beach, VA) y al anotar suavemente el ajuste.
- Para lograr la nitidez deseada, químicamente grabar un extremo de la punta de la fibra en un 1% (v / v) de ácido nítrico (grado reactivo) solución. Verticalmente y sumerja el extremo seleccionado de la fibra en la solución de ácido a una profundidad de 300 a 500 m después del contacto inicial. Después de aproximadamente 15 minutos de aguafuerte, la punta de forma espontánea se separará de la superficie del ácido. Esto resulta en una afilada punta de la fibra con radio de ~ 15 m de la curvatura. Enjuague con agua destilada para eliminar cualquier residuo ácido.
- Montaje final grabada de la fibra en un micromanipulador (MN-151, Narishige, Tokio, Japón) y llevarlo a la proximidad (~ 20 m) de la superficie de la célula para la deposición de energía eficiente.
- Sostenga el extremo opuesto al grabado de la fibra óptica por una fibra desnuda tirada (BFC300, Siskiyou Corporation, de Grants Pass, Oregón). Para la alineación óptica, la tirada de fibra se monta en un traductor de cinco ejes (BFT-5, Siskiyou Corporation, de Grants Pass, Oregón). La energía del láser (0,5 a 1 mJ) está acoplado en la fibra de enfocar el haz de un fluoruro de calcio plano-convexo o lentes antireflejos ZnSe recubierto (infrarrojos productos ópticos, Farmingdale, NY) en su no-grabado final. Protegidos espejos de oro (PF10-03-M01, Thorlabs, Newton, Nueva Jersey) se utilizan para dirigir el rayo láser infrarrojo medio en el anillo de enfoque.
2. Electrospray configuración
- El sistema de electrospray se pueden construir con los siguientes componentes: la unión de metal con puntera perfluoroelastómero conductores, accesorios, manga tubos, agujas puerto (por ejemplo, U-435, M215, M-331Nx, F-242x, 9013, respectivamente IDEX Salud y Ciencias, Oak Harbor, WA), así como tubos de sílice fundido (por ejemplo, CT360-100-50-5, Nuevo Objetivo Inc., Woburn, MA). El emisor se recomienda es de acero inoxidable y tiene una punta cónica con un identificador de 50 micras (por ejemplo, MT320-50-5-5, Nuevo Objetivo Inc., Woburn, MA).
- Prepare solución al 50% de metanol con 0,1% de ácido acético (v / v) para el electrospray. La solución es bombeada a un ritmo de 200 a 300 nl / min por una bomba de jeringa (Harvard Apparatus, Holliston, MA), utilizando, por ejemplo, un. Jeringa 500 l (81 222, la empresa Hamilton, Reno, NV)
- Aplicar alto voltaje entre 2.800 y 3.000 V para la unión de metales por una fuente de alimentación regulada (PS350, Stanford Research Systems Inc, Sunnyvale, CA) para generar un electrospray estable. Asegúrese de que todas las conexiones eléctricas estén seguras y protegidas con el blindaje a tierra. El contacto directo con alto voltaje descubierto puede provocar una descarga eléctrica.
3. De manipulación de muestras
- Obtener el tejido vivo o una muestra de células de una fuente apropiada y mantenerlos lo más recomendable antes del análisis. El Allium cepa bombillas para esta demostración fueron comprados en una tienda local. Cortar una bombilla longitudinalmente por un bisturí quirúrgico. Un segmento de unos pocos centímetros de la escala se seccionó en una tira. Una monocapa intacta del tejido epidérmico interior se despega.
- La superficie húmeda de la epidermis se usa para montar el tejido sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio limpiado previamente. Sostenga el deslizador por el titular de la placa de propósito general (FP01, Thorlabs Inc., Newton, Nueva Jersey) montado en una etapa de traducción de tres ejes para el posicionamiento. Adquisición de los espectros de masas inmediatamente después del montaje de la muestra para evitar la degradación de la célula.
4. Sistema de visualización
- Dos microscopios de larga distancia se utilizan para seleccionar las células para su análisis y para mantener la distancia entre la punta de la fibra afilada y la superficie celular. Éste está montado en ángulo de 15 ° y 30 ° medidos desde la superficie. Este sistema consiste en aldistancia ong microscopio de vídeo (7x zoom óptico de precisión, Edmund Optics, Barrington, NJ), con una infinidad de 5x lente con corrección objetiva (Apo M Plan de 5x, Mitutoyo Co., Kanagawa, Japón) equipado con una cámara CCD (Marlin F131, Allied Vision Technologies , Stadtroda, Alemania) para el seguimiento y captura de imágenes.
- El microscopio segundo video está montado en un ángulo recto con la superficie de la muestra para visualizar las células de la parte superior. Este sistema proporciona una retroalimentación visual para alinear el extremo de la fibra sobre la celda seleccionada para la ablación y el análisis. Se trata de un zoom óptico 7x precisión (Edmund Optics, Barrington, NJ), equipado con una infinidad de 10x corregido largo lente objetivo de trabajo a distancia (M Plan de 10x Apo, Mitutoyo Co., Kanagawa, Japón) y una cámara CCD.
5. Adquisición de espectros de masas
- Encienda el láser, electrospray y el espectrómetro de masas, por ejemplo, un sistema de cuadrupolo-tiempo de vuelo (Q-TOF Premier, Waters, Milford, MA). Optimizar la geometría de la fuente de iones LAESI ajustando la posición del punto de ablación y el emisor electrospray respecto a la otra y el orificio del espectrómetro de masas para lograr la intensidad máxima de iones.
- Seleccione la celda de interés para el análisis utilizando el sistema de visualización de primera vista. Después de la selección, mover el escenario de la muestra para que la celda seleccionada directamente por debajo de la punta afilada de la fibra óptica. Con el microscopio vista lateral reajustar la punta-a-distancia de la superficie celular de aproximadamente 20 micras.
- Fuego pulsos de láser en la celda seleccionada a través de la punta de la fibra grabado. Este resultado en la perforación de la pared celular y la expulsión del citoplasma en forma de partículas. Después de postionization por el electrospray, los iones producidos son recogidos por el espectrómetro de masas y los espectros de masas se registran.
- Después de la adquisición de datos, puesto que el láser, electrospray y el espectrómetro de masas en modo de espera o apagarlos. Mantenga la ablación A. cepa muestra de tejido para su observación al microscopio óptico opcional.
6. Resultados representante
Éxito de la ablación de una sola célula en los resultados de la explosión de la pared celular y la colección de un espectro de masas LAESI. Un experimento sin éxito por lo general da lugar a ninguna de ablación y / o no hay un espectro de masas. Para fines de demostración, se presentan los resultados del análisis LAESI-MS de una sola célula epidérmica incrustado de una A. cepa del bulbo. La figura 2a muestra una imagen representativa de microscopía óptica tras la toma de muestras de una célula. La pared celular es perforada y el alcance de la perforación está limitada por las fronteras con las células vecinas. Las células adyacentes parecen estar intactas. La Figura 2b muestra un espectro representativo LAESI producidos en masa de la célula. Una gran variedad de iones se detectan a partir de la A. cepa de células y en base a sus masas precisas, patrones de isótopos de distribución, y, en algunos casos, los espectros de masas en tándem, que son asignados provisionalmente a metabolitos endógenos. Los iones detectados a partir de una sola célula fueron similares a los observados en el análisis del tejido mismo convencionales LAESI-MS de varias celdas. 13
Figura 1. Esquemática de análisis de células individuales por LAESI-MS. Un pulso de láser infrarrojo medio se une en una fibra óptica y entregado a la muestra colocada en el portaobjetos de vidrio. La afilada punta de la fibra se concentra la luz en la celda de destino y la energía depositada estalla la célula. La pluma de ablación producido (puntos rojos) se combina con una pluma de electrospray (puntos negro) que las gotas se unen (puntos verdes) que resulta en la producción de iones de la muestra específica. Estos iones son analizadas y detectadas por el espectrómetro de masas (MS). Dos microscopios de vídeo larga distancia, un microscopio y el microscopio 2, se utilizan para controlar la distancia entre la punta de la fibra y la superficie de la célula y para seleccionar una celda para el análisis, respectivamente.
Figura 2a. Ablación marca en una sola célula epidérmica de una A. cepa del bulbo. Las células adyacentes no presentan daños visibles y, posteriormente, se pueden analizar por separado.
Figura 2b. Masa correspondiente a la ablación de un solo espectro A. cepa de células epidérmicas muestra la presencia de metabolitos primarios y secundarios.
Discussion
El contenido de agua del citoplasma celular y la resistencia a la tracción de la pared o membrana celular son factores fundamentales que rigen la ablación de las células individuales en LAESI-MS análisis. La fluencia del láser tiene que ser ajustada para alcanzar los umbrales de la ablación de los diferentes tipos de células. La fluencia del láser entrega depende de la energía del pulso láser y de la distancia entre la punta de la fibra y la superficie celular. Minimizar la perturbación de las células vecinas durante el análisis de células individuales es crítico. Mantener la energía del láser en el umbral de ablación limita el efecto del análisis de las células adyacentes.
Una de las posibles aplicaciones es usar las células individuales, como los píxeles naturales volumétrico (voxels) para la industria química de imágenes por la EM. En comparación con la recopilación de datos en una cuadrícula rectangular artificial a menudo, de imagen química de un tejido de una célula a la vez es más probable que mantener la organización espacial de las interacciones bioquímicas entre las células.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores agradecen el apoyo financiero de las siguientes instituciones: la Fundación Nacional de Ciencias (Grant 0.719.232), el Departamento de Energía (Grant DEFG02-01ER15129), la WM Keck Foundation (subvención 041.904), y la Universidad George Washington, el Fondo de Investigación de mejora. Los autores están agradecidos por las fibras ópticas GeO2 basada generosamente proporcionados por los sistemas de fibra de infrarrojos (Silver Spring, MD), así como para la discusión inicial sobre el Protocolo en relación con el grabado de fibra por Mark E. Reeves y Joan A. Hoffmann, de la George Washington universidad. Los autores también desean agradecer a Jessica A. Stolee por su ayuda durante la grabación en vídeo del protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Fluka | 45727 | |
| Methanol | Fluka | 65548 | |
| 1-methyl-2-pyrrolidinon | Sigma-Aldrich | M79603 | |
| Water | Fluka | 39259 |
References
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