Summary
हम एक संवेदनशील व्यक्ति की कोशिकाओं में नए संश्लेषित mitochondrial डीएनए (mtDNA) लेबल क्रम में mtDNA biogenesis अध्ययन तकनीक विकसित की है. तकनीक EDU के समावेश के साथ एक tyramide संकेत प्रवर्धन प्रोटोकॉल (TSA) के साथ न्यूरॉन्स के subcellular डिब्बों के भीतर mtDNA प्रतिकृति कल्पना को जोड़ती है.
Abstract
Mitochondria सेलुलर ऊर्जा के प्रमुख नियामकों और mitochondrial biogenesis स्वस्थ 1-3 कोशिकाओं में mitochondria की संख्या विनियमन का एक आवश्यक घटक है . Mitochondrial biogenesis निगरानी के लिए एक दृष्टिकोण mitochondrial डीएनए (mtDNA) प्रतिकृति चार की दर को मापने है . हम एक संवेदनशील व्यक्ति की कोशिकाओं में नव संश्लेषित mtDNA लेबल क्रम में mtDNA biogenesis अध्ययन तकनीक विकसित की है. तकनीक (EDU) 5 - ethynyl - 2'- deoxyuridine tyramide संकेत प्रवर्धन (TSA) 8 प्रोटोकॉल mtDNA प्रतिकृति subcellular डिब्बों के भीतर न्यूरॉन्स की कल्पना के साथ 5-7 का समावेश को जोड़ती है. Edu 5 - ब्रोमो - 2 - deoxyuridine (BrdU) जैसे अन्य thymidine analogs, बेहतर है, क्योंकि प्रारंभिक लेबल 5-7 EDU के लिए क्लिक करें प्रतिक्रिया कठोर एसिड उपचार या एंजाइम हज़म कि BrdU मिलान को उजागर करने के लिए आवश्यक हैं की आवश्यकता नहीं है . Edu की मामूली लेबलिंग अन्य सेलुलर 9-10 मार्कर के साथ अपने निगमन के प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है . कल्पना करने और mtDNA biogenesis यों की क्षमता mitochondrial biogenesis को विनियमित और दवा विषाक्तता, उम्र बढ़ने, कैंसर और neurodegenerative रोगों के साथ जुड़े रोगजनन में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा करने के लिए इस्तेमाल किया तंत्र की जांच के लिए एक आवश्यक उपकरण प्रदान करता है. हमारी तकनीक संवेदी न्यूरॉन्स के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए लागू होता है. mtDNA biogenesis को मापने के लिए इस तकनीक का उपयोग दोनों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सामान्य सेलुलर फिजियोलॉजी बिगड़ा रोग राज्यों की समझ को आगे बढ़ाने में महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है है.
Protocol
1. न्यूरॉन्स की तैयारी
- पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स (DRG) बाँझ (autoclaved) 24 अच्छी तरह से एक संस्कृति थाली में 12 मिमी कांच coverslips पर उगाए जाते हैं.
- EDU के 10 मिमी शेयर (DMSO, क्लिक करें यह edu Microplate परख किट में) आम तौर पर मध्यम संस्कृति में 1:100 पतला एक 10X Edu समाधान (100 सुक्ष्ममापी) बनाने और फिर संस्कृति कुओं में 1:10 पतला (30 उदा संस्कृति के माध्यम से 300 μL के कुल में 10X Edu समाधान) के μL. DRG न्यूरॉन्स 10 सुक्ष्ममापी EDU के अंतिम एकाग्रता के साथ 37 पर incubated हैं डिग्री सेल्सियस और 5% 2-24 घंटे के बीच सीओ 2. समय की लंबाई कैसे उपचार mtDNA संश्लेषण की दर को प्रभावित पर निर्भर करता है.
- धूआं हुड में, न्यूरॉन्स DRG कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए 2% paraformaldehyde में तय कर रहे हैं, 1X पीबीएस 2-5 मिनट प्रत्येक धोने में दो बार धोया और ताजा 1X पीबीएस में संग्रहीत 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस
- Coverslips ठीक इत्तला दे दी संदंश के साथ तैयार नम कक्ष में स्थानांतरित कर रहे हैं (Corning इसके विपरीत के लिए काला papered नीचे के साथ bioassay पकवान, एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे प्रकाश के प्रति संवेदनशील उपकरणों और जल संतृप्त Kimwipes के साथ humidified की रक्षा) और Parafilm एम के एक पत्रक पर रखा है कि प्रदान करता है एक hydrophobic सतह coverslip के लिए समाधान को सीमित करने के लिए. नीचे प्रोटोकॉल 28 coverslips के लिए डिज़ाइन किया गया है और समाधान 32 coverslips (14% अतिरिक्त मात्रा के बारे में) के लिए तैयार हैं. महंगा या सीमित घटकों के साथ समाधान बना रहे हैं ताकि 75-80 μL प्रत्येक coverslip पर इस्तेमाल किया जाता है. अन्यथा, 200-300 μL धोने और ब्लॉक समाधान के लिए उपयोग किया जाता है अच्छी तरह से बाहर पिछले समाधान धो.
- 1X पीबीएस प्रत्येक coverslip (200-300 μL) की सतह को कवर करने के लिए पुन: लागू होते हैं. परख क्लिक करें और tyramide संकेत प्रवर्धन के रूप में नीचे और निर्माता के निर्देशों में वर्णित किट तैयार करें.
क्लिक - EDU Microplate परख किट तैयार
क्लिक करें यह Edu Microplate परख किट से ज्यादातर घटक आते पूर्व बना रहे हैं और 4 में संग्रहीत ° सी [क्लिक करें 2x यह रिएक्शन (10x घटक ई) बफर, CuSO4 (100 मिमी, एफ घटक), क्लिक करें यह Edu लगानेवाला ( डी घटक) और अवरुद्ध (2x घटक एच) बफर]. क्लिक करें यह Edu बफर Additive (10x घटक जी) -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है यह समय के साथ पीले भूरे रंग बदल से रोकने. इस घटक को दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र बर्दाश्त.
ओरेगन ग्रीन 488 azide (घटक बी) छोटे aliquots (10-20 μL) में विभाजित किया जाना चाहिए फ्रीज पिघलना चक्र को कम करने और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत
विरोधी ओरेगन ग्रीन एचआरपी संयुग्म (मैं घटक) के एक शेयर समाधान तैयार करने के लिए, शीशी मिल्ली क्यू dh 2 हे 75 μL जोड़ें. कोमल pipetting या उलटा द्वारा मिक्स foaming से बचने और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस भंवर नहीं करो.
एचआरपी विरोधी खरगोश बकरी आईजीजी और alexa Fluor 488 Tyramide किट के साथ 12 TSA किट की तैयारी,
Tyramide शेयर समाधान तैयार करने के लिए, DMSO (घटक बी) के 150 μL में ठोस सामग्री भंग (Alexa Fluor 488 tyramide, एक घटक). शीशी के लिए किसी भी tyramide कोटिंग शीशी की तरफ भंग कई बार उलटें. स्टोर छोटे aliquots में शेयर -20 ≤ पर (10-20 μL) समाधान डिग्री सेल्सियस, desiccated और प्रकाश से सुरक्षित है.
2. क्लिक करें यह 5-ethynyl-2-deoxyuridine लेबल (EDU)
नोट: सभी समाधान एक 200 μL अंत तक चिपका टिप करने के लिए धीरे कोशिकाओं को खोने के बिना तरल पदार्थ को हटाने के साथ एक बल्ब हस्तांतरण विंदुक के साथ हटा रहे हैं. एक निर्वात लाइन, जो आमतौर पर समाधान भी सख्ती हटायें का उपयोग करने से बचें. एक बल्ब विंदुक धीरे से धोने के समाधान के 200-300 μL के साथ coverslips बाढ़ अच्छी तरह से बाहर पिछले समाधान धोने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- कक्ष 0.1% एक कवर नम कक्ष में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1X पीबीएस समाधान में ट्राइटन-X-100 के साथ permeabilized हैं. 1% ट्राइटन-X-100 शेयर समाधान का उपयोग करें.
- 300 μL% 1 जोड़ने 2700μL 1X पीबीएस ट्राइटन-X-100 शेयर 0.1% ट्राइटन-X-100 के 3000 μL बनाओ.
- Coverslip प्रति 75-80 μL का उपयोग करें.
- Triton एक्स 100 समाधान निकालें और 1X पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला.
- अंतर्जात peroxidase की गतिविधि एक 1% 1X पीबीएस समाधान में एच 2 2 हे कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए द्वारा बुझती है. 30% एच 2 हे 2 1X पीबीएस के साथ समाधान पतला . यह समाधान ताजा किया जाना चाहिए, लेकिन 10 मिनट permeabilization ऊपर चरण (3.1 कदम) के दौरान बनाया जा सकता है है.
- 2900 μL 1X पीबीएस 100 μL 30% एच 2 2 हे जोड़कर एक 1% एच 2 2 हे के 3000 μL बनाओ.
- Coverslip प्रति 75-80 μL का उपयोग करें.
- Peroxidase समाधान निकालें और 1X पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला.
- क्लिक करें यह Edu रिएक्शन
- 32 coverslips (32 x 80 μL = के लिए2560) μL 2560 μL के कुल की जरूरत है. 2x प्रतिक्रिया 1280 μL है, जो प्रतिक्रिया की कुल मात्रा का आधा है में किया जाता है.
- हौसले रिएक्शन क्लिक करें यह कॉकटेल से पहले तैयार करने के लिए 5 मिनट के बाद तय (3.5 कदम नीचे) शुरू.
- ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कॉकटेल मिक्स. भंवर जब इस प्रतिक्रिया बनाने मत करो.
2 एक्स रिएक्शन कॉकटेल
अवयव क्लिक - EDU Microplate परख किट से कर रहे हैंआधा वॉल्यूम: 1280 μL मिल्ली क्यू dh 2 हे 1132.8 μL 2x रिएक्शन क्लिक करें यह बफर (10x घटक ई) 100.3 μL क्लिक करें यह Edu बफर Additive (10x घटक जी) 25.6 μL CuSO 4 (100 मिमी, घटक एफ) 25.6 μL ओरेगन ग्रीन azide (घटक) 6.4 μL कुल 1290.7 μL
नोट: ऊपर प्रयोग किया जाता मात्रा क्लिक करें यह Edu Microplate परख किट दिशाओं में सूचीबद्ध संस्करणों के लिए आनुपातिक हैं. रिएक्शन कॉकटेल के अंतिम मात्रा थोड़ा 1280 μL से अधिक है. - 2X क्लिक करें यह प्रतिक्रिया Edu लगानेवाला (घटक डी) के सही उपयोग से पहले क्लिक करें यह बराबर मात्रा के साथ पतला है. ये एक साथ मिलाकर देखना सभी coverslips के लिए एक समान प्रतिक्रिया समाधान बनाता है.
- 1290.7 μL प्रतिक्रिया कॉकटेल 1290.7 μL क्लिक करें यह Edu लगानेवाला (घटक डी) जोड़ें. Coverslip प्रति 75-80 μL का उपयोग करें.
- क्लिक - यह कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए EDU लगानेवाला (घटक डी) के साथ न्यूरॉन्स पोस्ट तय कर लो.
- ठीक निकालें और ऊपर (3.4 कदम) से प्रतिक्रिया कॉकटेल जोड़ने. प्रकाश से बचाने के लिए और कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए सेते कवर. धीरे रिएक्शन कॉकटेल को हटा दें. पतला 1X अवरुद्ध बफर (2X घटक एच) के साथ दो बार धोएं.
- MilliQ घ एच 2 हे (2600 μL) के एक समान मात्रा के साथ 2600 μL अवरुद्ध बफर (2x घटक एच) गिराए द्वारा 1X अवरुद्ध बफर के 5200 μL बनाओ. Coverslip प्रति 75-80 μL का उपयोग करें.
- एक महामारी फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के तहत, ओरेगन mitotically सक्रिय नियंत्रण कोशिकाओं के नाभिक में ग्रीन धुंधला के लिए जाँच करें.
3. Tyramide Edu सिग्नल के सिग्नल के प्रवर्धन (TSA)
- प्रत्येक coverslip 1% TSA ब्लॉक समाधान जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- TSA अवरुद्ध अभिकर्मक के 0.06 g (TSA # 12 किट, घटक डी) वजन और यह 6000 μL 1X पीबीएस जोड़ने के द्वारा 1% TSA ब्लॉक समाधान के 6000 μL बनाओ. मिश्रण भंवर. 5% 1% TSA ब्लॉक समाधान में बकरी सीरम के अलावा अक्सर गैर विशिष्ट बंधनकारी को कम करने में मदद करेगा.
- संक्षेप में स्पिन विरोधी ओरेगन ग्रीन हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित एंटीबॉडी (मैं क्लिक करें यह Edu Microplate परख के घटक) शेयर, TSA के अग्रिम में 2-24 घंटे तैयार है. % 1 TSA अवरुद्ध समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी 1:300 पतला और पलटना या ऊपर और नीचे विंदुक धीरे मिश्रण करने के लिए. एचआरपी - संयुग्मित एंटीबॉडी में खलल न डालें से बचने के भंवर मत करो. 1% TSA ब्लॉक समाधान निकालें, प्रत्येक coverslip 75 μL जोड़ने और 4 में रात भर सेते डिग्री सेल्सियस
- अधिक केंद्रित एंटीबॉडी इस्तेमाल किया जा सकता है, 1:150 जैसे, लेकिन यह सीमित मात्रा में आपूर्ति है, तो यह किफ़ायत का उपयोग करें. फिर, 5% 1% TSA ब्लॉक समाधान में बकरी सीरम के अलावा अक्सर गैर विशिष्ट विरोधी ओरेगन ग्रीन हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित एंटीबॉडी के बंधन को कम करने में मदद करेगा.
- शेयर खरगोश ग्रीन एचआरपी विरोधी ओरेगन (8.53 μL जोड़कर एक 1:300 एंटीबॉडी समाधान के 2560 μL करें क्लिक करें मैंटी Edu Microplate 2560 μL 1% TSA अवरुद्ध) परख. कोमल pipetting या उलटा द्वारा मिक्स.
- अगले दिन, एंटीबॉडी समाधान निकालें और 1X पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला. एक अतिरिक्त कमरे के तापमान पर 30-60 मिनट के लिए सुनिश्चित करें कि अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी निकाल दिया जाता है के लिए अंतिम धोने में coverslips सेते हैं.
- ΜL 2560 (32 coverslips x 80 μL) के लिए Tyramide प्रतिक्रिया तैयार.
- 398 μL प्रवर्धन बफर (TSA # 12 किट, घटक ई) के लिए 30% एच 2 2 हे (TSA # 12 किट, एफ घटक) के 2 μL जोड़कर 0.15% एच 2 हे 2 समाधान (100X) के 400 μL बनाओ . यह सही से पहले की जरूरत बना होना चाहिए.
- ΜL 2560 के अंतिम मात्रा के लिए गठबंधन:
- 25.6 μL Tyramide 488 (TSA किट एक घटक)
- 2508.8 μL प्रवर्धन बफर (TSA किट घटक ई)
- 25.6 μL 0.15% 2 एच ओ 2 (ऊपर से अंतिम 0.००१५% एच 2 2 हे के लिए )
- 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर Tyramide प्रतिक्रिया के साथ 1X पीबीएस और सेते निकालें.
- Tyramide प्रतिक्रिया निकालें और 1X पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला, पहले के रूप में 30-60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंतिम धोने में incubating.
- MtDNA लेबलिंग के लिए एक महामारी फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के तहत की जाँच करें.
- कांच खुर्दबीन स्लाइड पर इस तरह के रूप में एक antifade बढ़ते मध्यम, के साथ माउंट coverslips DAPI के साथ गोल्ड लम्बा. वैकल्पिक रूप से, Edu लेबलिंग और प्रवर्धन मानक फ्लोरोसेंट immunocytochemistry अन्य सेलुलर मार्करों लेबल द्वारा पीछा किया जा सकता है.
4. Mitochondrial biogenesis के लिए एक मार्कर के रूप में Mitochondrial डीएनए प्रतिकृति के विज़ुअलाइज़ेशन: प्रतिनिधि परिणाम
हम कैसे संवेदी न्यूरॉन्स (चित्रा 1) mitochondria की संख्या को विनियमित में रुचि रखते हैं. इस प्रोटोकॉल एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ नए mitochondria को मापने का एक तरीका के रूप में नए संश्लेषित mtDNA लेबल होगा. सिंथेटिक nucleotide क्लिक Alexa Fluor एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट संकेत (चित्रा 2) के साथ mtDNA की लेबलिंग में 488 tyramide परिणाम के साथ ओरेगन ग्रीन azide और बाद प्रवर्धन के रसायन शास्त्र द्वारा पीछा Edu का समावेश है. यदि सही ढंग से किया, प्रवर्धित हरी झंडी पर्याप्त पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (जैसे सेलुलर autofluorescence या एचआरपी TSA प्रतिक्रिया के पक्ष प्रभाव के रूप में) से अधिक है.
इस तकनीक नव दोहराया mtDNA लेबल क्रम में करने के लिए कल्पना और न्यूरॉन्स (चित्रा 3) के subcellular डिब्बों के भीतर mtDNA biogenesis यों के लिए डिज़ाइन किया गया है. Edu लेबलिंग बाद फ्लोरोसेंट immunocytochemistry के लिए अनुमति देता है neurofilament (चित्रा 3 डी) के रूप में अन्य सेलुलर मार्करों लेबल.
TSA प्रतिक्रिया भी अन्य Alexa 594 tyramide Fluor जैसे फ्लोरोसेंट Alexa Fluor tyramides के साथ किया जा सकता है. ओरेगन ग्रीन azide नाभिक में क्लिक करें प्रतिक्रिया लेकिन mtDNA, जो TSA के लिए पहले undetectable है में कोई हरी झंडी से एक हरे रंग फ्लोरोसेंट परमाणु संकेत में यह परिणाम है. एलेक्सा 594 tyramide Fluor के साथ प्रवर्धन परमाणु लेबल तेज और एक लाल फ्लोरोसेंट संकेत (चित्रा 4) के साथ mtDNA में शामिल Edu से पता चलता है. इसी प्रकार का एक प्रवर्धन प्रक्रिया नव संश्लेषित mtDNA (चित्रा 5) में BrdU समावेश कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है, तथापि, इस विधि का एक अतिरिक्त कदम या तो एक कठोर एसिड (एचसीएल) या एंजाइम पचाने में है, जो EDU के लिए आवश्यक नहीं है BrdU मिलान द्वारा ठीक करने के लिए की आवश्यकता है लेबलिंग.
चित्रा 1. भ्रूण के प्रतिनिधि अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) छवियाँ (बाएं) और (दाएं) वयस्क पृष्ठीय रूट (DRG) नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स कि आम तौर पर विश्लेषण = 10 सुक्ष्ममापी. बार्स के लिए उपयोग किया जाता है.
चित्रा 2. योजनाबद्ध आरेख. MtDNA में एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट संकेत के साथ EDU लेबलिंग के लिए प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व योजनाबद्ध mtDNA में एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट संकेत के साथ EDU लेबलिंग के लिए तीन कदम प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करता है. Mitotically सक्रिय F11 neuroblastoma कोशिकाओं एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा और EDU की लेबलिंग पैटर्न है कि परमाणु और mitochondrial डीएनए में शामिल किया गया था वर्णन. पहला कदम है (P1) नव संश्लेषित mtDNA में EDU की उपस्थिति में incubating कोशिकाओं द्वारा thymidine अनुरूप शामिल है. दूसरा कदम (P2) ग्रीन azide ओरेगन के साथ शामिल Edu लेबल क्लिक करें रसायन विज्ञान पर आधारित है. ग्रीन संकेत है कि अपने परमाणु डीएनए दोहराया कोशिकाओं के नाभिक में दिखाई देता है. अंतिम चरण (पी 3) ओरेगन जीआर बढ़ाना हैeen-azide एचआरपी संयुग्मित ओरेगन ग्रीन के खिलाफ खरगोश एंटीबॉडी के साथ incubating संकेत Alexa Fluor हाइड्रोजन पेरोक्साइड की उपस्थिति में 488 लेबल tyramide (2 एच 2 हे) mtDNA में हरी झंडी कल्पना के साथ ऊष्मायन द्वारा पीछा किया.
चित्रा 3. Edu पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि में mtDNA की लेबलिंग (DRG) न्यूरॉन्स न्यूरॉन्स EDU के साथ incubated हैं और संकेत के बाद mtDNA कि शामिल Edu प्रकट परिलक्षित होता है. प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति प्रकाश दोनों भ्रूण (ए) और (बी) वयस्क DRG न्यूरॉन्स के नव संश्लेषित mtDNA में शामिल प्रवर्धित Edu (EDU ओग - TSA, हरा) की हरी कबरा संकेतों संचारित दिखा पर मढ़ा छवियों. Edu लेबलिंग प्रक्रिया neurofilament (डी, αNF, लाल रंग में) जैसे neuronal मार्करों के बाद immunofluorescence धुंधला के लिए अनुमति देता है. स्केल सलाखों = 10 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 4. योजनाबद्ध आरेख. MtDNA में एक लाल फ्लोरोसेंट संकेत के साथ EDU लेबलिंग के लिए प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व योजनाबद्ध mtDNA में एक लाल फ्लोरोसेंट संकेत के साथ EDU लेबलिंग के लिए तीन कदम प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करता है. Mitotically सक्रिय F11 neuroblastoma कोशिकाओं एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा और EDU की लेबलिंग पैटर्न है कि परमाणु और mitochondrial डीएनए में शामिल किया गया था वर्णन. पहला कदम है (P1) नव संश्लेषित mtDNA में EDU की उपस्थिति में incubating कोशिकाओं द्वारा thymidine अनुरूप शामिल है. दूसरा कदम (P2) ग्रीन azide ओरेगन के साथ शामिल Edu लेबल क्लिक करें रसायन विज्ञान पर आधारित है. ग्रीन संकेत है कि अपने परमाणु डीएनए दोहराया कोशिकाओं के नाभिक में दिखाई देता है. अंतिम चरण (पी 3) एक एचआरपी संयुग्मित ओरेगन ग्रीन के खिलाफ खरगोश एंटीबॉडी के साथ incubating द्वारा ओरेगन ग्रीन azide संकेत बढ़ाना है Alexa Fluor हाइड्रोजन पेरोक्साइड की उपस्थिति में 594 लेबल tyramide (2 एच 2 हे) कल्पना के साथ ऊष्मायन द्वारा पीछा mtDNA में लाल संकेत.
चित्रा 5. BrdU लेबलिंग और mtDNA में एक हरे या लाल फ्लोरोसेंट संकेत के साथ tyramide संकेत प्रवर्धन योजनाबद्ध आरेख. नव संश्लेषित mtDNA में या तो एक हरे या लाल फ्लोरोसेंट संकेत के साथ BrdU लेबलिंग के लिए प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है. एक प्रारंभिक कदम के लिए या तो एक एसिड (एचसीएल) या एंजाइम पचाने में है, जो Edu लेबलिंग के लिए आवश्यक नहीं है के द्वारा BrdU मिलान पुनर्प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. अगले कदम के साथ एक माउस प्राथमिक एंटीबॉडी विरोधी BrdU incubating है. यह एक हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित बकरी प्रतिरक्षी विरोधी माउस के साथ incubating द्वारा पीछा किया जाता है. अंत में, संकेत एक हरे या लाल हाइड्रोजन पेरोक्साइड की उपस्थिति में fluorescently लेबल tyramide (2 एच 2 हे) mtDNA में संकेत कल्पना के साथ परिलक्षित होता है.
Discussion
हम एक संवेदनशील व्यक्ति EDU के एक tyramide संकेत प्रवर्धन का उपयोग कोशिकाओं में नव संश्लेषित mtDNA लेबल परख विकसित किया है. इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन के दौरान सबसे बड़े मुद्दों में से एक coverslips बीच असंगत परिणाम था. Invitrogen किट प्रोटोकॉल के लिए परिवर्तन किए गए व्यक्ति coverslips पर छोटे मात्रा मिश्रण और मास्टर समाधान सभी coverslips के लिए उपयोग करने के लिए से बचने के. 75-80 प्रत्येक 12 मिमी परिपत्र कांच coverslip के लिए इस्तेमाल किया μL एक आदर्श के लिए पूरी तरह से सतह क्षेत्र को कवर जबकि नमूनों के बीच अनुरूप परिणाम देने के लिए पर्याप्त समाधान प्रदान मात्रा है. ऊष्मायन समय और अभिकर्मक सांद्रता अनुकूलित थे, लेकिन उनके लिए समायोजन के साथ सुधार देखा जा सकता है.
प्रोटोकॉल प्रत्येक प्रक्रिया एक बार चलाने के लिए डिज़ाइन किया गया है. हालांकि, कदम से कुछ नए समाधानों के साथ दोहराया गया नमूने है कि पहले प्रयास के बाद असफल रहा ठीक. विशेष रूप से, Edu क्लिक करें प्रतिक्रिया कदम (3.4-3.6) पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में एक उल्लेखनीय वृद्धि के बिना दोहराया गया है. विरोधी ओरेगन एंटीबॉडी ग्रीन एचआरपी (4.1-4.3) ऊष्मायन और tyramide (4.4-4.5) प्रवर्धन कदम भी दोहराया गया है, लेकिन अधिक बार वृद्धि की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की वजह से शोर अनुपात करने के लिए एक गरीब संकेत में परिणाम है.
सबसे संवेदनशील अभिकर्मकों क्लिक करें यह Edu बफर (घटक जी) और क्लिक करें यह Edu Microplate परख किट से खरगोश विरोधी ओरेगन ग्रीन एचआरपी एंटीबॉडी (मैं घटक) Additive हैं. क्लिक करें यह Edu बफर Additive धीरे - धीरे समय के साथ पीले रंग बदल जाता है जब 4 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस और 6-12 महीने के बीच काफी darkens. सी -20 ° पर क्लिक करें यह Edu बफर Additive का भंडारण इस मुद्दे पर कम होगा. लेबलिंग और tyramide प्रवर्धन कदम का सबसे अच्छा काम है जब विरोधी ओरेगन खरगोश ग्रीन एचआरपी एंटीबॉडी MilliQ DH 2 ओ में पुनर्गठन के 4-6 महीने के भीतर प्रयोग किया जाता है
mtDNA में EDU के हल्के लेबलिंग अतिरिक्त सेलुलर 9-11 मार्करों के साथ प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है और अन्य thymidine analogs पर इस तकनीक का (BrdU 5) - ब्रोमो - 2 - deoxyuridine, जो ठीक करने के लिए एक कठोर उपचार की आवश्यकता के रूप में, उपयोगिता को बढ़ाता है डीएनए के भीतर अपनी मिलान. हमारे 11-12 प्रयोगशाला और दूसरों को 13-15 सफलतापूर्वक BrdU mtDNA लेबल का इस्तेमाल किया है. BrdU लेबलिंग तकनीक EDU के लिए इस्तेमाल किया एक के समान है, लेकिन कुछ महत्वपूर्ण अंतर (चित्रा 5) है. Permeabilization ऊपर सूचीबद्ध कदम (3.1-3.2) के बाद, BrdU मिलान एक विकृतीकरण कदम के साथ बरामद किया है (37 पर 30 मिनट के लिए 2 एन एचसीएल ° सी 1X पीबीएस में तीन washes के द्वारा पीछा किया). BrdU तो BrdU के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल है (वेक्टर प्रयोगशालाओं TSA किट से 1% अवरुद्ध समाधान में 1:50 और पतला 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात incubated). एक माध्यमिक एंटीबॉडी कदम BrdU संकेत (बकरी आईजीजी विरोधी माउस TSA # 2 # 5 किट, 1:100 पतला 1% अवरुद्ध समाधान में से एचआरपी संयुग्मित और 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated) से पहले बढ़ाना करने के लिए की जरूरत है TSA कदम (4.3-4.5 ऊपर). लेबल mtDNA दो thymidine analogs, Edu और BrdU, दोहरी लेबल प्रयोगों जहां mtDNA sequentially पल्स लेबलिंग 11 मानदंड में लेबल किया जा सकता है है प्रदर्शन के लिए फायदेमंद है .
हमारी प्रयोगशाला Edu और mtDNA के BrdU लेबलिंग का उपयोग कर रहा है मधुमेह न्युरोपटी, मधुमेह की एक आम समस्या के संदर्भ में mitochondrial biogenesis का विनियमन की जांच. हम सफलतापूर्वक संकेत प्रवर्धन mtDNA biogenesis में व्यक्तिगत 11-12 न्यूरॉन्स में बदलाव को मापने का इस्तेमाल किया है. इस तकनीक को अन्य mtDNA प्रतिकृति और कारोबार के या दवाओं है कि mtDNA संश्लेषण को बाधित की पहचान के लिए तंत्र का पता लगाने के लिए डिज़ाइन प्रयोगों में उपयोगी हो जाएगा. इसके अलावा, amplifying Edu और BrdU संकेतों के बुनियादी सिद्धांतों के अन्य अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है कि उपाय डीएनए प्रतिकृति या मरम्मत.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान के संस्थानों एन एस 38,849 डी.के. और 076,160, किशोर मधुमेह मधुमेह में जटिलताओं के अध्ययन के लिए रिसर्च फाउंडेशन केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था, न्यूरोलॉजी अनुसंधान और डिस्कवरी और ए अल्फ्रेड Taubman चिकित्सा अनुसंधान संस्थान के लिए कार्यक्रम मिशिगन विश्वविद्यालय. यह काम आकृति विज्ञान और मिशिगन मधुमेह अनुसंधान और प्रशिक्षण केन्द्र, मधुमेह और पाचन और गुर्दा रोग के राष्ट्रीय संस्थान से राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान डी.के. २०,५७२ 5P60 संस्थान द्वारा वित्त पोषित की छवि विश्लेषण कोर का इस्तेमाल किया. लेखकों आण्विक जांच / Invitrogen से अपने पर बहुमूल्य सलाह के लिए धन्यवाद स्कॉट टी. क्लार्क विभिन्न क्लिक करें - यह किट और अभिकर्मकों के उदार दान लेबलिंग Edu प्रवर्धन तकनीक के प्रारंभिक विकास का समर्थन Edu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 245 mm x 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | |
| Parafilm M | Fisher Scientific | PM-996 | |
| paraformaldehye | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8532 | |
| Phosphate buffered saline 10X solution | Fisher Scientific | BP399 | |
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Hydrogen peroxide, 30% in water | Fisher Scientific | BP2633 | |
| Click-iT EdU Microplate Assay Kit | Invitrogen | C10214 | |
| TSA Kit #12, with HRP—goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide | Invitrogen | T20922 | |
| TSA Kit #15, with HRP–goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide | Invitrogen | T20925 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Polyclonal rabbit Neurofilament antibody | Chemicon International | AB1981 | |
| Mouse monoclonal anti-BrdU antibody | Vector Laboratories | VP-B209 | |
| TSA Kit #2, with HRP—goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide | Invitrogen | T20912 | |
| TSA Kit #5, with HRP—goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide | Invitrogen | T20915 |
References
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