Summary
Hier presenteren wij een montage protocol voor gebrandschilderde
Abstract
Verschillende bekende morfogenetische gradiënten en cellulaire bewegingen optreden langs de dorsale / ventrale as van de
Protocol
1. Imaging Methodologie
- Gelei Smelt glycerine in een 55 ° C graden waterbad gedurende 20-30 minuten tot het een homogene vloeistof. Swirl, doe maar niet schudden de fles om de vorming van luchtbellen te voorkomen.
- Terwijl de gelei smelt, breng een dunne laag van glycerol met behulp van een Kimwipe op een schoon glasplaatje (optioneel).
- Pipetteer 1 tot 1,5 ml gesmolten glycerine gelei met behulp van een cut P1000 pipettip op het oppervlak van de dia om een dunne eerste laag te creëren. Pipet voorzichtig om luchtbellen te vermijden.
- Laat de gelei stollen gedurende 5 minuten op een horizontaal oppervlak, dan is de schuif plaats bij -20 ° C gedurende 5 minuten en ga verder met embryo uitlijning. U kunt ook betrekking hebben op de dia met Saran Wrap en plaats deze bij 4 ° C gedurende maximaal 5 dagen.
- Pipetteer een kleine druppel gekleurd embryo's in 70% glycerol / PBS of andere antifade glycerol-based montage media (bijvoorbeeld Slowfade of Vectashield) aan de zijde van de gelei beddengoed.
- Begin pre-embryo's door het afstemmen van de individueel over te dragen van de drop naar de gelei oppervlak. Overbrengen met behulp van een schuine injectienaald, het gebruik van de schuine zijde als een lepel.
- Ruwweg plaats van de embryo's langs de 2 tot 3 kolommen. Als een embryo vast komt te zitten in de naald, roer het in de druppel die de andere embryo's om deze los. Verspil geen tijd zorgvuldig uitlijnen hen op dit punt. Laat wat ruimte tussen de kolommen.
- Lijn de embryo's door ze horizontaal op de gelei medium met behulp van de injectienaald. Tijdens het glijden, oriënteren de koppen en staarten in dezelfde richting. Maak ze parallel aan elkaar langs de kolom. Verwijder overtollig van PBS glycerol links als een parcours met een stukje gedraaid Kimiwipe.
Let op: Excess glycerol zal leiden tot embryo's te losjes verpakt binnen gel, wat resulteert in scheiding van de twee gelei lagen, waardoor het moeilijk om te knippen en te monteren. Omgekeerd zal het verwijderen van te veel glycerol droog en plat embryo's. - Gebruik een afgezaagd geel tip om een dun laagje gelei verspreid over de embryo's (50-150 pi, afhankelijk van hoeveel waren uitgelijnd).
- Plaats dia in -20 ° C vriezer voor 10-20 min. of bewaar deze bij 4 ° C gedurende de nacht. Zorg ervoor dat de gelei is helemaal stijf voor het snijden. Anders zal het blok van de embryo's zeer moeilijk te accijnzen. De beste resultaten voor het snijden worden verkregen op de volgende dag.
- Onder een ontleding bereik, gebruik dan een scheermesje om volledig dwars door de gelei op beide zijden van de lijn embryo's. Houd het scheermesje in een hoek van 90 ° rechte zaagsneden te maken. De bezuinigingen moeten worden gemaakt zeer dicht bij de voorste en achterste polen van de embryo's om overtollige gelei die kunnen belemmeren beeldvorming te voorkomen.
- Voeg 100 tot 200 ul van koude PBT (4 ° C, PBS +0,1% Tween 20) naast de bezuinigingen en voorzichtig afschrapen van de gelei tussen embryo's met behulp van een spatel.
Opmerking: Het wasmiddel in PBT helpt bij het verwijderen van de gelei van de dia zonder beschadiging van de embryo's. - Met behulp van een naald, de overdracht het blok van de gelei met embedded embryo's op een schoon objectglas voor verdere snijden. Gesneden kleinere blokken met 5-7 embryo's. Gebruik PBT om gemakkelijk te verplaatsen rond de gelei blok. Als alternatief, plaats het blok op een droge ondergrond te laten hechten aan het glas, waardoor meer stabiliteit voor het precies trimmen van de gelei, indien nodig, creëert.
- Flip rechtop de embryo's ingebed in de gelei met behulp van een scheermesje en een naald. Voor visualisatie onder de microscoop, ga dan verder met een van de twee onderstaande stappen, afhankelijk van het type microscoop stand wordt gebruikt.
- Omkeermicroscoop: plaats embryo blokken afgewerkt op een lange dekglaasje, met embryo's in een rechtopstaande positie. Zorg ervoor dat de zijde van het embryo met de minste hoeveelheid gelei zal in nauwer contact met de doelstelling.
- Rechtop microscoop: maak twee stapels met vier # 1 coverslips gelijmd met superlijm om gebruikt te worden als "ondersteunt", en het embryo blok in glycerol plaats in tussen de "ondersteunt". Brug de stapels met behulp van een lange dekglaasje aan.
- Voor de confocale analyse, controleer dan de werkafstand van de doelstellingen die moeten worden gebruikt om te achterhalen of u foto helemaal door het embryo of slechts gedeeltelijk. Bijvoorbeeld, D. melanogaster embryo's ~ 0,55 mm in lengte en kan volledig worden afgebeeld met behulp van een Zeiss 20x Plan-Apo of een 40x LD Neo-Fluor doelstelling. De volgende website is informatie over de beschikbare Zeiss doelstellingen en geeft u de mogelijkheid om doelstellingen te zoeken op werkafstanden: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php
2. Representatieve resultaten
Omdat het embryo intact worden gelaten, kan deze methode worden gebruikt om nauwkeurige metingen van embryo grootte en afstanden tussen de genexpressie patronen te nemen. In figuur 1 geven we een blastoderm stadium embryo's gekleurd met de nucleaire vlek DAPI (blauw), anti-Dorsale eiwit (rood), SOG mRNA (geel) en SNA mRNA (groen). Morfologische processes, kan zoals invaginatie van het mesoderm (Figuur 2A, B) en migratie van mesodermale cellen (Figuur 3 en 4) ook worden gevisualiseerd met behulp van deze methode. Verschillende Z-posities langs de DV-as kan worden verkregen door het veranderen van de focal plane, zoals weergegeven in de figuren 2-4.
Figuur 1. Rechtop optische schijfje van een intacte embryo in blastoderm stadium. Dubbelklik kleuring voor mRNA en eiwit. Doelwit mRNA's voor in-situ sondes (SOG en SNA) en eiwit gekleurd door primaire antilichaam (anti-Dorsale) zijn aangegeven in de figuur. DAPI werd gebruikt om de kernen label. Merk op dat de uitdrukking van SOG en SNA apicaal bevinden zich in het cytoplasma, terwijl de uitdrukking van Dorsale is kernenergie. Sterke signalen van SOG ontluikende transcripten die zich bevinden in de kernen is ook te zien op deze vergroting.
Figuur 2. Rechtop beeldvorming van een intacte gastrulating embryo. MRNA probes gebruikt en de bijbehorende kleuren zijn aangegeven in de figuur. A) Merk op dat in dit stadium, drie genen gekleurd met dezelfde Fluor (SNA, SOG en DPP, in het groen), worden uitgedrukt in ruimtelijk gescheiden domeinen. De invaginating mesoderm drukt SNA, de neuroblast laag drukt IND en het ectoderm uitdrukt DPP, terwijl de SOG uitdrukking is nog steeds aanwezig in ventrale regio's van het zenuwstelsel. B) In een diepere confocale vliegtuig van hetzelfde embryo, merken we de basis van het invaginating mesoderm sterk tot uitdrukking SNA, maar de apicale regio uitdrukt lagere niveaus.
Figuur 3. Rechtop beeldvorming van een intacte embryo met een kiem band uitgebreid SOG RNA (geel);. Slak, IND en DPP mRNAs (groen), Dorsale eiwit (rood). Kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). A) Focal plane in de buurt van embryo hoofd. B) Een ander focal plane in de kofferbak regio van hetzelfde embryo. Let op de massa van mesodermale cellen voordat laterale migratie (te vergelijken met 4 figuur) liggen dicht bij de ventrale middellijn aan beide zijden van een kiem-band uitgebreid embryo. Delamineren neuroblasts zijn geëtiketteerd in groen (IND en SNA).
Figuur 4. Rechtop beeldvorming van een intacte embryo tijdens de kiem band extensie SOG RNA (geel);. Slak, IND en DPP mRNAs (groen), Dorsale eiwit (rood). A) Let op de delamineren neuroblasts van het epitheel (pijl), gebeitst zowel voor de IND en SNA in dit stadium (groen). Let ook op de beperkte uitdrukking van SOG aan de ventrale middellijn (geel). Expressie van DPP in dit stadium te zien op zijkanten van het embryo (asterisk). B) Optische gedeelte in dezelfde embryo getoond in A aan het einde van het embryo lengte, die overeenkomt met mid-posterior regio. Het ventrale middellijn cellen zijn gekleurd voor SOG.
Discussion
Het nemen van doorsnede beelden van Drosophila embryo's kan lastig zijn, omdat het vereist hetzij een zorgvuldige hand dissectie van de plakjes 2 of het gebruik van embedded media voor de verwerking van microtoom, die meestal nadelig is voor tl-kleuringen. Als alternatief kan Z-stacks in een confocale microscoop worden gebruikt om de 3D-reconstructie van de doorsnede beelden te maken. Het is echter tijdrovend om meerdere dunne plakjes Confocale zorgen voor een nauwkeurige 3D-reconstructie en fotobleking wordt problematisch. Een andere zorg bij de beeldvorming embryo's die in lengterichting zijn gemonteerd is de lichtverstrooiing die optreedt bij het bereiken van diepere delen van het embryo, die ook bemoeilijkt het nemen van nauwkeurige metingen van fluorescerende signalen ten behoeve van kwantificering van eiwit of mRNA expressie niveaus 1. Zelfs met een twee-foton confocale microscoop, lichtverstrooiing is nog een probleem vanwege de ondoorzichtigheid van de dooier materiaal in het midden van het embryo, welke selectie van montage media voor optimale transparantie van het monster te beperkt maakt.
Om deze problemen te omzeilen, een nieuwe techniek genaamd "End-on" beeldvorming van de positionering embryo's verticaal werd onlangs ontwikkeld om beeld zowel live als vaste monsters 4. In deze paper hebben we een nieuw protocol voor verticaal geplaatste embryo's dat een eenvoudige voorbereiding en visualisatie van de vaste embryo's of weefsels van elke grootte en vorm die met meerdere gebeitst in situ sondes 3 mogelijk maakt. Onze methode bestaat uit het gebruik van een montage media met een geleiachtige consistentie die wordt gebruikt om embryo's zet je lijn binnen het. Snijd blokjes van deze montage media met embedded embryo's kan rechtop worden geplaatst voordat beeldvorming in elk type van confocale microscoop.
Door het inbedden van de embryo's in de gelei en plaats ze verticaal, we zijn in staat om horizontale doorsnede te nemen met behulp van confocale microscopie, waarbij cellen langs de dorsale-ventrale as van het embryo gelijktijdig worden gepresenteerd. Dit is een significante verbetering voor de kwantificering werken, omdat problemen van lichtverstrooiing en fotobleken van fluorescerende kleurstoffen die optreedt bij conventionele Z-stack reconstructie van lengterichting gemonteerde embryo's zijn nu geëlimineerd. Zo, kwantificering van genexpressie of eiwit niveaus langs de rug-buik as is nauwkeurig, aangezien cellen zich aan tegenover rug-buik posities worden afgebeeld op hetzelfde tijdstip en op dezelfde confocale Z-positie. Daarnaast kan de beschreven methode stelt ons in staat om een complete 2-D beeld te krijgen over de rug-ventrale as van een 3-D-embryo zonder het gebruik van complexe computationele afrollen methoden om cellen op verschillende posities langs de DV-as 6 visualiseren.
Een aantal van de kritische stappen omvatten het verwijderen van overtollige glycerol na het uitlijnen van embryo's, om te voorkomen dat verdeeld tussen de twee lagen van gelei. Echter, als het monster te uitgedroogd, zal het resulterende beeld worden misvormd en verkeerd morfologie. Bovendien, als de gelei medium rond het embryo wordt gesneden in een hoek in plaats van recht, kan het resulterende beeld lijken minder rond en meer ovular in vorm, als gevolg van een verkeerde positionering van de embryo's op een andere hoek dan 90 graden. Tot slot, als de gelei is niet nauw genoeg is gesneden om de embryo op de voorste / posterior eindigt, is het niet mogelijk om een goed beeld te krijgen, want de doelstelling van de werkafstand zou vooral gebruikt worden om zich te concentreren in de gelei en niet het embryo.
Een andere belangrijke stap die nodig kunnen zijn bij het beeld laat gastrulating embryo is om zorgvuldig de stadia van belang soort onder de reikwijdte voor het uitlijnen hen. Meestal worden embryo's opgevoerd op basis van morfologische kenmerken die kunnen de meeste gemakkelijk te herkennen wanneer in een longitudinale positie.
Onder andere wijzigingen die kunnen worden gemaakt met deze methode is om een anti-fade reagens (bv p-fenyleendiamine of PPD) op te nemen in de tweede laag van gelei te helpen beschermen tegen fotobleken van fluorescerende kleurstoffen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs zijn vooral schatplichtig aan Deborah Harris en Danielle MacKay. Steun voor dit werk werd geleverd door het departement Biologie en de Hogeschool voor de Kunsten en Wetenschappen van CWRU, en door HHMI verlenen nummer 52005866 voor de ondersteuning van undergraduate onderwijs in de biologische wetenschappen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerin Jelly mounting media | Electron Microscopy Sciences | 17998-10 | Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997. |
| Zeiss LSM 700 Confocal | Carl Zeiss, Inc. | The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm). | |
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT) | |||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Glass cover slips | Electron Microscopy Sciences | 72204-02 | Size 1 ½ (specific for the objectives used in this work). |
| Glass cover slips (for making supports) | Fisher Scientific | 12-544-10 | Use four coverslips glued with superglue. |
| Dissection microscope | M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop | M420 | |
| Razor blade | Steel back single edge industrial blades | ||
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Hypodermic needles | Fisher Scientific | 1482610 | 26 Gauge |
| Pipettes | Labnet International |
References
- Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos. Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).
- Grβhans, J., Wieschaus, E. A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila. Cell. 101, 523-531 (2000).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).
- Zander, R. H. On mounting delicate bryophytes in glycerol. The Bryologist. 100, 380-382 (1997).
- Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).
