Summary
Nous présentons ici un protocole de montage pour teinté
Abstract
Plusieurs gradients morphogénétiques connus et les mouvements cellulaires se produisent le long de l'axe dorsal / ventral de l'
Protocol
1. Méthodologie d'imagerie
- Faire fondre la gelée de glycérine dans un bain d'eau à 55 ° C degrés pendant 20-30 minutes jusqu'à ce qu'elle devienne un liquide homogène. Swirl, mais ne secouez pas la bouteille pour éviter la formation de bulles.
- Alors que la gelée fond, appliquer une fine couche de glycérol à l'aide d'un Kimwipe sur une lame de verre propre (en option).
- Pipette de 1 à 1,5 ml de glycérine fondue gelée à l'aide d'une pointe de pipette P1000 coupe sur la surface de la diapositive pour créer une première couche mince. Pipeter avec précaution pour éviter les bulles.
- Laissez la gelée de solidifier pendant 5 min sur une surface horizontale, puis placer la lame à -20 ° C pendant 5 min et procéder à l'alignement embryon. Alternativement, couvrir la lame avec le Saran Wrap et le placer à 4 ° C pendant 5 jours.
- Introduire à la pipette une petite goutte d'embryons colorés dans du glycérol 70% / PBS ou autres Antifade glycérol à base de milieu de montage (par exemple Slowfade ou Vectashield) sur le côté de la litière gelée.
- Commencez pré-alignement des embryons parindividuellement les transférer à partir du menu à la surface gelée. Transférez-les à l'aide d'une aiguille hypodermique inclinée, en utilisant le côté incliné comme une cuillère.
- Environ placer les embryons ainsi que 2 à 3 colonnes. Si un embryon se coince dans l'aiguille, remuer dans la liste déroulante contenant les embryons d'autres pour le libérer. Ne perdez pas de temps avec soin en les alignant à ce stade. Laissez de l'espace entre les colonnes.
- Aligner les embryons en les faisant glisser horizontalement sur le support gelée à l'aide de l'aiguille hypodermique. Tout en faisant glisser, orienter les têtes et les queues dans la même direction. Rendre parallèles les uns aux autres le long de la colonne. Enlever l'excès de glycérol PBS laissé comme une traînée avec un morceau de Kimiwipe torsadée.
Remarque: le glycérol en excès entraîne des embryons pour être lâchement enfermée à l'intérieur du gel, ce qui entraîne la séparation des couches de gelée deux, ce qui rend difficile à découper et à monter. En revanche, la suppression de glycérol trop de sécher et aplatir embryons. - Utiliser un embout de coupe jaune pour diffuserune fine couche de gelée sur les embryons (50-150 ul, selon la façon dont beaucoup ont été alignés).
- Placer la lame dans congélateur à -20 ° C pendant 10-20 min ou le stocker à 4 ° C pendant la nuit. Assurez-vous que la gelée est complètement rigide avant de couper. Sinon, le bloc d'embryons sera très difficile à exciser. Les meilleurs résultats sont obtenus pour la coupe le lendemain.
- Sous un microscope à dissection, utiliser une lame de rasoir pour couper complètement à travers la gelée sur les deux côtés des embryons alignés. Maintenez la lame de rasoir à un angle de 90 ° pour réaliser des coupes droites. Les coupes doivent être faites très près des pôles antérieur et postérieur de l'embryon pour éviter les excès de gelée qui peuvent entraver l'imagerie.
- Ajouter 100-200 ul de froid PBT (4 ° C, PBS + 0,1% Tween 20) à côté des coupes et soigneusement gratter la gelée entre les embryons à l'aide d'une spatule.
Remarque: Le détergent en PBT permet l'élimination de la gelée de la glissière sans endommager les embryons. - L'utilisation d'un e aiguille, transferte bloc de gelée avec des embryons intégrés à une lame propre pour couper davantage. Couper les petits blocs avec des embryons 5-7. Utilisez PBT de se déplacer facilement autour du bloc de gelée. Sinon, placez le bloc sur une surface de verre sec pour laisser fixent sur le verre, ce qui crée plus de stabilité pour justement couper la gelée, le cas échéant.
- Retourner verticalement les embryons noyées dans la gelée à l'aide d'une lame de rasoir et une aiguille. Pour la visualisation au microscope, soit procéder à une des deux étapes ci-dessous, en fonction du type de Pied pour microscope utilisé.
- Microscope inversé: fini les blocs d'embryons lieu sur une lamelle de long, avec des embryons dans une position verticale. Faire en sorte que le côté de l'embryon avec le moins de gelée sera en contact plus étroit avec l'objectif.
- Microscope droit: faire deux piles de quatre lamelles collées # 1 avec de la superglue pour être utilisé comme "supports" et placez le bloc d'embryons dans du glycérol entre les «supports». Combler les piles à l'aide d'unlamelle longue.
- Pour l'analyse confocale, vérifiez la distance de travail des objectifs à utiliser pour savoir si vous pouvez l'image tout au long de l'embryon ou seulement partiellement. Par exemple, D. embryons ont melanogaster ~ 0,55 mm de longueur et peut être entièrement imagé en utilisant un Zeiss 20x plan-Apo ou un 40x LD Neo-Fluor objectif. Le site suivant contient des informations sur les objectifs Zeiss disponibles et vous donne la possibilité aux objectifs de recherche en fonction de distances de travail: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php
2. Les résultats représentatifs
Parce que les embryons sont laissés intacts, cette méthode peut être utilisée pour effectuer des mesures précises de la taille des embryons et les distances entre les profils d'expression génique. Dans la figure 1, nous montrons une embryons au stade blastoderme colorées avec du DAPI tache nucléaire (bleu), la protéine anti-dorsale (rouge), l'ARNm sog (jaune) et l'ARNm sna (vert). Proces morphologiques session, comme l'invagination du mésoderme (Figure 2A, B) et la migration des cellules mésodermiques (figure 3 et 4) peuvent également être visualisés à l'aide de cette méthode. Différentes positions Z le long de l'axe DV peut être obtenue en modifiant le plan focal, comme représenté sur les figures 2-4.
Figure 1. Upright tranche optique d'un embryon intact au stade blastoderme. Double coloration pour l'ARNm et de protéines. ARNm cibles pour sondes in situ (sog et sna) et colorées par la protéine anticorps primaire (anti-dorsale) sont indiqués sur la figure. DAPI est utilisé pour marquer les noyaux. Notez que l'expression de sog et sna sont situés dans le cytoplasme apical, alors que l'expression de la dorsale est d'origine nucléaire. Des signaux forts de transcriptions SOG naissantes qui sont situés dans les noyaux peuvent aussi être vus à ce grossissement.
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Figure 2. Imagerie verticale d'une sonde d'ARNm intacts gastrulating embryon. Utilisés et leurs couleurs respectives sont indiquées sur la figure. A) A noter que dans cette étape, trois gènes colorées avec la même fluor (sna, sog et dpp, en vert), sont exprimés dans des domaines séparés dans l'espace. Le mésoderme invagination exprime sna, la couche de neuroblastes exprime salle et l'ectoderme exprime dpp, tandis que l'expression sog est toujours présente dans les régions ventrales du système nerveux. B) Dans un plan plus profond confocale de l'embryon même, nous notons la base du mésoderme invagination exprime fortement sna, mais sa région apicale exprime des niveaux inférieurs.
Figure 3. Imagerie verticale d'un embryon intact avec bande germe étendu sog ARN (jaune);. Escargot, salle et dpp (ind et sna).
Figure 4. Imagerie verticale d'un embryon intact pendant extension de bande germe sog ARN (jaune);. Escargot, salle ARNm et DPP (vert), la protéine dorsale (rouge). A) Notez les neuroblastes délamination de l'épithélium (flèche), teinté à la fois pour salle et sna à ce stade (vert). On notera également l'expression restreinte de SOG à la ligne médiane ventrale (jaune). L'expression de dpp à ce stade peut être vu sur les côtés latéraux del'embryon (astérisque). B) l'article optique dans l'embryon même représentée en A proximité de l'extrémité de la longueur de l'embryon, qui correspond à la mi-postérieur région. Les cellules sont colorées ligne médiane ventrale pour sog.
Discussion
Prendre des images des sections efficaces d'embryons de drosophile peut être difficile, car elle nécessite soit une dissection minutieuse de la main tranches 2 ou l'utilisation de médias intégrés pour le traitement microtome, qui est généralement néfaste pour les colorations fluorescentes. En variante, Z-empilements réalisés dans un microscope confocal permet de faire de la reconstruction 3D de section transversale des images. Cependant, il est temps de faire plusieurs tranches fines confocale pour une reconstruction 3D précise et photoblanchiment devient problématique. Un autre problème lorsque les embryons d'imagerie qui sont montés longitudinalement est la diffusion de la lumière qui se produit lorsqu'il atteint sections plus profondes de l'embryon, ce qui complique également prendre des mesures précises de signaux fluorescents dans le but de quantifier les niveaux d'expression de protéine ou d'ARNm 1. Même avec un microscope à deux photons confocale, diffusion de la lumière est toujours un sujet de préoccupation en raison de l'opacité de la matière jaune dans le milieu de l'embryon, Qui permet la sélection de supports de montage pour une transparence optimale de l'échantillon à être limitée.
Pour contourner ces problèmes, une nouvelle technique appelée "End-on" l'imagerie des embryons de positionnement vertical a été récemment mis au point à l'image en direct et des échantillons fixes 4. Dans cet article, nous avons développé un nouveau protocole pour les embryons montés verticalement qui permet une préparation simple et la visualisation des embryons fixes ou des tissus de n'importe quelle taille et la forme sont colorées avec de multiples sondes in situ 3. Notre procédé consiste à utiliser un support de montage avec consistance gélatineuse qui est utilisée pour envelopper embryons alignés à l'intérieur de celui-ci. Couper des blocs de ce support de montage intégrés contenant des embryons peut être placé en position verticale avant l'imagerie dans tout type de microscope confocal.
En intégrant les embryons dans la gelée et les positionner à la verticale, nous sommes en mesure de prendre horizontales sections en utilisant la microscopie confocale, dans lequel les cellules along de l'axe dorso-ventral de l'embryon sont présentés simultanément. Il s'agit d'une amélioration significative des fins de quantification, car les problèmes de diffusion de la lumière et de photoblanchiment des colorants fluorescents qui se produit dans conventionnelle Z-stack reconstruction des embryons longitudinalement montés sont désormais éliminés. Ainsi, la quantification de l'expression du gène ou de la teneur en protéines selon l'axe dorso-ventrale est exacte, car les cellules situées à opposées dorsal-ventral positions sont imagés en même temps et à la même confocale Z-position. En outre, la méthode décrite permet d'obtenir une complète 2-D image sur l'axe dorso-ventral de l'embryon 3-D sans utiliser de méthodes complexes de déroulage de calcul pour visualiser les cellules à différentes positions le long de l'axe DV 6.
Certaines des étapes essentielles incluent le retrait du glycérol en excès après alignement des embryons, afin d'éviter répartis entre les deux couches de gelée. Toutefois, si l'échantillon est trop déshydraté, le résultatment l'image sera déformée et ont une morphologie incorrecte. En outre, si le milieu de la gelée autour de l'embryon est coupé à un angle plutôt que droite, l'image résultante peut apparaître moins rond et plus en forme ovulaire, en raison d'un mauvais positionnement des embryons à un angle autre que 90 degrés. Enfin, si la gelée n'est pas coupé assez près de l'embryon sur les extrémités antérieure / postérieure, il n'est pas possible d'obtenir une image correcte car la distance de travail de l'objectif serait principalement utilisé pour focaliser dans la gelée et pas l'embryon.
Une autre étape importante qui peut être nécessaire lorsque l'imagerie embryon fin gastrulating est de bien trier les stades d'intérêt dans le champ avant de les aligner. Habituellement, les embryons sont mis en scène en fonction des caractéristiques morphologiques qui peuvent être plus facilement reconnus lorsqu'il est en position longitudinale.
Parmi les modifications alternatives qui peuvent être faites avec cette méthode est d'inclure un anti-faderéactif (par exemple p-phénylènediamine ou PPD) dans la seconde couche de gelée pour la protection contre le photoblanchiment de colorants fluorescents.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs sont particulièrement reconnaissants à Deborah Harris et Danielle MacKay. Prise en charge de ce travail a été fourni par le ministère de la biologie et de l'Ordre des Arts et des Sciences de CWRU, et par HHMI subvention nombre 52005866 faveur de l'éducation de premier cycle en sciences biologiques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerin Jelly mounting media | Electron Microscopy Sciences | 17998-10 | Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997. |
| Zeiss LSM 700 Confocal | Carl Zeiss, Inc. | The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm). | |
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT) | |||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Glass cover slips | Electron Microscopy Sciences | 72204-02 | Size 1 ½ (specific for the objectives used in this work). |
| Glass cover slips (for making supports) | Fisher Scientific | 12-544-10 | Use four coverslips glued with superglue. |
| Dissection microscope | M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop | M420 | |
| Razor blade | Steel back single edge industrial blades | ||
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Hypodermic needles | Fisher Scientific | 1482610 | 26 Gauge |
| Pipettes | Labnet International |
References
- Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos. Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).
- Grβhans, J., Wieschaus, E. A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila. Cell. 101, 523-531 (2000).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).
- Zander, R. H. On mounting delicate bryophytes in glycerol. The Bryologist. 100, 380-382 (1997).
- Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).
