Summary
हम यहाँ मौजूद दाग के लिए एक बढ़ते प्रोटोकॉल
Abstract
कई प्रसिद्ध morphogenetic gradients और सेलुलर आंदोलनों के पृष्ठीय / वेंट्रल अक्ष के साथ होते हैं
Protocol
1. इमेजिंग पद्धति
- ग्लिसरीन जेली एक 55 ° 20-30 मिनट के लिए सी डिग्री पानी के स्नान में जब तक यह एक समरूप तरल हो जाता है पिगलो. , भंवर, लेकिन बुलबुले के गठन से बचने की बोतल हिला नहीं करते.
- जबकि जेली पिघला देता है, एक साफ कांच स्लाइड (वैकल्पिक) पर एक Kimwipe का उपयोग कर ग्लिसरॉल की एक पतली परत लागू होते हैं.
- पिपेट पिघला ग्लिसरीन का 1 से 1.5 एमएल जेली स्लाइड की सतह पर एक कट P1000 विंदुक टिप का उपयोग करने के लिए एक पतली पहली परत बनाने. सावधानी पिपेट बुलबुले से बचने के के लिए.
- जेली जमना एक क्षैतिज सतह पर 5 मिनट के लिए, तो -20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए स्लाइड और जगह भ्रूण संरेखण के लिए आगे बढ़ना. वैकल्पिक रूप से, सरन लपेटें के साथ स्लाइड कवर और 4 ° C पर यह 5 दिनों के लिए जगह है.
- 70% ग्लिसरॉल / पीबीएस जेली बिस्तर के किनारे पर या अन्य ग्लिसरॉल आधारित antifade बढ़ते मीडिया (जैसे Slowfade या Vectashield) में दाग भ्रूण की एक छोटी सी बूंद पिपेट.
- व्यक्तिगत जेली सतह के लिए ड्रॉप से उन्हें स्थानांतरित द्वारा भ्रूण पूर्व aligning शुरू करो. उन्हें स्थानांतरण एक slanted चमड़े के नीचे सुई का उपयोग करते हुए, एक चम्मच के रूप में slanted पक्ष का उपयोग.
- मोटे तौर पर 2 से 3 कॉलम के साथ भ्रूण जगह. यदि एक भ्रूण सुई में अटक जाता है, यह अन्य भ्रूण इसे रिलीज करने के लिए युक्त बूंद में हलचल. ध्यान से उन्हें इस बिंदु पर aligning समय बर्बाद मत करो. स्तंभों के बीच कुछ जगह छोड़ें.
- उन्हें क्षैतिज चमड़े के नीचे सुई की सहायता के साथ जेली मध्यम पर फिसलने से भ्रूण संरेखित करें. जबकि फिसलने, एक ही दिशा में सिर और पूंछ उन्मुख. उन्हें स्तंभ के साथ एक दूसरे के समानांतर. पीबीएस ग्लिसरॉल से अधिक निकालें मुड़ Kimiwipe का एक टुकड़ा के साथ एक पगडंडी के रूप में छोड़ दिया है.
नोट: अतिरिक्त ग्लिसरॉल कारण भ्रूण शिथिल encased जेल के भीतर हो, दो जेली परतों की जुदाई में जिसके परिणामस्वरूप, यह मुश्किल में कटौती और माउंट बनाने. इसके विपरीत, बहुत ग्लिसरॉल हटाने सूखी और भ्रूण को समतल करना होगा. - भ्रूण (50-150 μL, कितने गठबंधन थे के आधार पर) पर जेली की एक पतली परत फैल कटौती पीले टिप का उपयोग.
- -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 10-20 मिनट के लिए प्लेस स्लाइड या यह 4 डिग्री सेल्सियस रात भर दुकान. सुनिश्चित करें कि जेली काटने से पहले पूरी तरह से कठोर है. अन्यथा, भ्रूण के ब्लॉक आबकारी करने के लिए बहुत मुश्किल हो जाएगा. अगले दिन काटने के लिए सर्वश्रेष्ठ परिणाम प्राप्त कर रहे हैं.
- एक विदारक गुंजाइश के तहत, एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें जेली के माध्यम से पूरी तरह से गठबंधन भ्रूण के दोनों पक्षों पर कटौती. एक 90 ° करने के लिए सीधे कटौती करने के कोण पर धार पकड़ो. कटौती भ्रूण की पूर्वकाल और कूल्हों डंडे के लिए बहुत करीब है कि इमेजिंग में बाधा डालती सकता है अतिरिक्त जेली से बचने के लिए किया जाना चाहिए.
- ठंड पीबीटी (4 ° सी, पीबीएस 0.1% के बीच 20) में कटौती और सावधानी से एक रंग का उपयोग भ्रूण के बीच जेली परिमार्जन करने के लिए अगले. 100-200 μL जोड़ें
नोट: पीबीटी में डिटर्जेंट जेली के भ्रूण को नुकसान पहुँचाए बिना स्लाइड से हटाने में मदद करता है. - एक सुई का प्रयोग, आगे काटने के लिए एक साफ स्लाइड एम्बेडेड भ्रूण के साथ जेली के ब्लॉक हस्तांतरण. 5-7 भ्रूण के साथ छोटे ब्लॉकों कट. पीबीटी का प्रयोग करें आसानी से जेली खण्ड के चारों ओर स्थानांतरित. वैकल्पिक रूप से, एक सूखी कांच की सतह पर ब्लॉक जगह इसे गिलास है, जो ठीक जेली trimming, यदि आवश्यक करने के लिए और अधिक स्थिरता पैदा करने के लिए देते हैं.
- ईमानदार एक रेजर ब्लेड और एक सुई की सहायता के साथ जेली में एम्बेडेड भ्रूण पलटें. खुर्दबीन के नीचे दृश्य के लिए, नीचे दो चरणों के या तो एक के साथ आगे बढ़ना है, माइक्रोस्कोप के प्रकार पर निर्भर करता है खड़े इस्तेमाल किया जा रहा है.
- उल्टे माइक्रोस्कोप: जगह एक ईमानदार स्थिति में भ्रूण के साथ एक लंबे coverslip पर भ्रूण ब्लॉक, समाप्त. सुनिश्चित करें कि जेली के कम से कम राशि के साथ भ्रूण की ओर उद्देश्य के साथ घनिष्ठ संपर्क में हो जाएगा.
- ईमानदार माइक्रोस्कोप: चार # 1 superglue के साथ सरेस से जोड़ा हुआ करने के लिए "का समर्थन करता है" के रूप में इस्तेमाल किया जा और "का समर्थन करता है" के बीच में ग्लिसरॉल में भ्रूण ब्लॉक जगह coverslips के साथ दो ढेर बनाने. एक लंबे समय coverslip का उपयोग ढेर ब्रिज.
- Confocal विश्लेषण के लिए, पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा उद्देश्यों की दूरी काम की जांच करने के लिए कि क्या आप छवि भ्रूण के माध्यम से सभी तरह से कर सकते हैं या केवल आंशिक रूप से. उदाहरण के लिए डी. मेलानोगास्टर भ्रूण ~ 0.55 मिमी की लंबाई में है और पूरी तरह से एक Zeiss 20x योजना ए पी ओ या एक 40x LD नव Fluor उद्देश्य का उपयोग imaged कर सकते हैं. निम्नलिखित वेबसाइट पर उपलब्ध Zeiss के उद्देश्यों पर जानकारी है और आप काम कर दूरी के अनुसार उद्देश्यों की खोज करने का विकल्प देता है: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php
2. प्रतिनिधि परिणाम
क्योंकि भ्रूण बरकरार रह गए हैं, इस विधि भ्रूण का आकार और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के बीच दूरी की सटीक माप लेने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 1 में, हम एक blastoderm मंच परमाणु दाग (नीला) DAPI, विरोधी पृष्ठीय प्रोटीन (लाल), एसओजी mRNA (पीला) और sna mRNA (हरा) के साथ दाग भ्रूण दिखा . Morphological प्रोसेसरसत्र, mesoderm के invagination (चित्रा 2A, बी) और mesodermal कोशिकाओं (चित्रा 3 और 4) के प्रवास के रूप में ऐसे भी देखे जा इस पद्धति का उपयोग कर सकते हैं. विभिन्न DV अक्ष के साथ Z-पदों फोकल हवाई जहाज़ को बदलने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, के रूप में 2-4 आंकड़े में दिखाया गया है.
चित्रा 1. ईमानदार blastoderm चरण में एक अक्षुण्ण भ्रूण के ऑप्टिकल टुकड़ा mRNA और प्रोटीन के लिए डबल धुंधला हो जाना. . सीटू जांच (एसओजी sna) और प्राथमिक एंटीबॉडी (विरोधी पृष्ठीय) द्वारा दाग प्रोटीन लक्ष्य mRNAs आकृति में संकेत कर रहे हैं. DAPI नाभिक लेबल इस्तेमाल किया गया था. ध्यान दें कि एसओजी और sna की अभिव्यक्ति apically cytoplasm में स्थित हैं, जबकि पृष्ठीय की अभिव्यक्ति परमाणु है . एसओजी नवजात टेप है कि नाभिक में स्थित हैं से मजबूत संकेतों भी इस बढ़ाई पर देखा जा सकता है .
चित्रा 2. एक अक्षुण्ण gastrulating भ्रूण के ईमानदार इमेजिंग. MRNA जांच का इस्तेमाल किया और उनके संबंधित रंग आंकड़ा में संकेत कर रहे हैं. एक) ध्यान दें कि इस चरण में, तीन जीनों वही fluor (sna, एसओजी और DPP हरे रंग में) के साथ दाग spatially अलग डोमेन में व्यक्त कर रहे हैं. invaginating mesoderm sna व्यक्त किया, neuroblast परत इंडस्ट्रीज़ व्यक्त बाह्य त्वक स्तर और DPP व्यक्त किया, जबकि एसओजी अभिव्यक्ति तंत्रिका तंत्र के उदर क्षेत्रों में अभी भी मौजूद है . बी) एक ही भ्रूण की एक गहरी confocal विमान में, हम invaginating mesoderm के आधार नोट जोरदार sna व्यक्त, लेकिन अपने शिखर क्षेत्र में निचले स्तर पर व्यक्त .
चित्रा 3. घोंघा, इंडस्ट्रीज़ और DPP mRNAs (हरा), पृष्ठीय प्रोटीन (लाल); SOG रोगाणु बैंड के साथ एक अक्षुण्ण भ्रूण के ईमानदार इमेजिंग (पीला) शाही सेना बढ़ाया. नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग थे. भ्रूण सिर के पास एक) नाभीय विमान है. बी) एक ही भ्रूण के ट्रंक क्षेत्र में एक और फोकल हवाई जहाज़. पार्श्व प्रवास से पहले mesodermal कोशिकाओं (चित्रा 4 तुलना) उदर midline पास एक रोगाणु बैंड विस्तारित भ्रूण के दोनों पक्षों पर झूठ बोल के नोट जन. Delaminating neuroblasts हरे (इंडस्ट्रीज़ और sna) में चिह्नित कर रहे हैं.
चित्रा 4. ईमानदार रोगाणु बैंड विस्तार के दौरान एक अक्षुण्ण भ्रूण के इमेजिंग SOG शाही सेना (पीला), घोंघा, इंडस्ट्रीज़ और DPP mRNAs (हरा), पृष्ठीय प्रोटीन (लाल). ए) उपकला (तीर) से delaminating neuroblasts नोट इंडस्ट्रीज़ और sna के लिए इस मंच (हरा) पर दोनों दाग. भी वेंट्रल midline (पीला) के लिए एसओजी को प्रतिबंधित अभिव्यक्ति ध्यान दें . इस चरण में DPP की अभिव्यक्ति भ्रूण (तारांकन) के पार्श्व पक्षों में देखा जा सकता है . बी) एक ही भ्रूण में ऑप्टिकल अनुभाग भ्रूण की लंबाई, जो मध्य पीछे क्षेत्र के लिए संगत के अंत के पास में दिखाया गया है. उदर midline कोशिकाओं एसओजी के लिए दाग रहे हैं.
Discussion
ड्रोसोफिला भ्रूण के पार अनुभाग छवियों लेना, चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि यह या तो 2 स्लाइस या सूक्ष्म तक्षणी प्रसंस्करण, जो आम तौर पर होता है फ्लोरोसेंट stainings के लिए हानिकारक के लिए एम्बेडेड मीडिया के उपयोग के एक सावधान हाथ विच्छेदन की आवश्यकता है. वैकल्पिक रूप से, एक confocal खुर्दबीन में बने Z-ढेर पार अनुभाग छवियों के 3D पुनर्निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, यह समय लगता है एक सटीक 3D पुनर्निर्माण और photobleaching problematical हो जाता है के लिए कई पतली स्लाइस Confocal है. एक और चिंता का विषय है जब इमेजिंग भ्रूण कि longitudinally बढ़ रहे हैं प्रकाश बिखरने है कि तब होता है जब भ्रूण है, जो भी संकेतों के फ्लोरोसेंट प्रोटीन या mRNA अभिव्यक्ति 1 स्तर की मात्रा का ठहराव के उद्देश्य के लिए सटीक माप लेने पेचीदा गहरी वर्गों तक पहुँचने है. यहां तक कि एक दो photon confocal खुर्दबीन के साथ, प्रकाश बिखरने अभी भी एक भ्रूण है, जो तक ही सीमित होना करने के लिए नमूने के इष्टतम पारदर्शिता के लिए बढ़ते मीडिया का चयन करता है के बीच में जर्दी सामग्री की अस्पष्टता के कारण चिंता का विषय है.
इन समस्याओं को दरकिनार करने के लिए, एक नया "अंत पर स्थिति भ्रूण की इमेजिंग तकनीक बुलाया खड़ी हाल ही में दोनों रहते हैं और अचल नमूने 4 छवि के लिए विकसित किया गया था. इस पत्र में, हम खड़ी घुड़सवार भ्रूण के लिए एक नए प्रोटोकॉल है कि अनुमति देता है एक सरल और किसी भी आकार और आकार है कि कई के साथ स्वस्थानी 3 जांच में दाग तय भ्रूण या ऊतकों की तैयारी दृश्य विकसित की है. हमारी विधि पतला संगति के साथ एक बढ़ते मीडिया है कि इसके भीतर गठबंधन भ्रूण डिब्बे में बंद करने के लिए प्रयोग किया जाता है का उपयोग करने के होते हैं. इस बढ़ते एम्बेडेड भ्रूण युक्त मीडिया के कट ब्लॉक Confocal खुर्दबीन के किसी भी प्रकार में इमेजिंग पहले तैनात ईमानदार हो सकते हैं.
जेली में भ्रूण एम्बेडिंग और उन्हें स्थिति खड़ी करके, हम क्षैतिज पार वर्गों ले confocal माइक्रोस्कोपी, जिसमें भ्रूण के उदर अक्ष पृष्ठीय साथ कोशिकाओं को एक साथ प्रस्तुत कर रहे हैं का उपयोग कर रहे हैं. यह प्रकाश बिखरने और फ्लोरोसेंट रंजक है कि longitudinally घुड़सवार भ्रूण के पारंपरिक जेड ढेर पुनर्निर्माण में होता photobleaching अब सफाया कर रहे हैं की समस्याओं के बाद से एक मात्रा का ठहराव के प्रयोजनों के लिए महत्वपूर्ण सुधार है. इस प्रकार, जीन अभिव्यक्ति या प्रोटीन का स्तर पृष्ठीय - वेंट्रल अक्ष साथ की मात्रा का ठहराव सटीक है, क्योंकि विपरीत पृष्ठीय वेंट्रल पदों पर स्थित कोशिकाओं को एक ही समय में और एक ही confocal Z स्थिति पर imaged हैं. इसके अलावा, वर्णित विधि हमें एक 3 - डी भ्रूण से अक्ष पृष्ठीय उदर भर जटिल कम्प्यूटेशनल unrolling तरीकों का उपयोग करने के लिए डीवी 6 अक्ष के साथ विभिन्न पदों पर कोशिकाओं कल्पना के बिना एक पूर्ण छवि 2 - डी प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है .
कुछ महत्वपूर्ण कदम भ्रूण aligning के बाद अतिरिक्त ग्लिसरॉल हटाने, जेली की दो परतों के बीच विभाजन से बचने के शामिल हैं. हालांकि, अगर नमूना भी निर्जलित है, जिसके परिणामस्वरूप छवि कुरूप हो सकता है और गलत आकारिकी है. इसके अलावा, अगर भ्रूण के आसपास जेली मध्यम सीधे के बजाय एक कोण पर काटा जाता है, जिसके परिणामस्वरूप छवि कम दौर और अधिक ovular आकार में, एक 90 डिग्री के अलावा अन्य कोण पर एक भ्रूण के गलत स्थिति के कारण प्रकट हो सकता है. अंत में, अगर जेली पर्याप्त निकट पूर्वकाल / पीछे समाप्त होता है पर भ्रूण में कटौती नहीं है, यह संभव है क्योंकि उद्देश्य की दूरी काम मुख्य रूप से जेली और नहीं भ्रूण में ध्यान केंद्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के लिए एक उचित छवि प्राप्त नहीं है.
एक अन्य महत्वपूर्ण कदम है कि आवश्यक हो सकता है जब इमेजिंग देर gastrulating भ्रूण ध्यान से गुंजाइश तहत पहले उन्हें aligning के हित के चरणों तरह हो सकता है. आमतौर पर, भ्रूण morphological विशेषताओं है कि सबसे अधिक आसानी से जब एक अनुदैर्ध्य स्थिति में मान्यता प्राप्त कर सकते हैं अनुसार मंचन कर रहे हैं.
वैकल्पिक संशोधनों है कि इस विधि के साथ बनाया जा सकता है है के अलावा जेली फ्लोरोसेंट रंजक के photobleaching के खिलाफ की रक्षा करने में मदद की दूसरी परत में एक विरोधी फीका अभिकर्मक (जैसे पी Phenylenediamine या पीपीडी) शामिल है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखक दबोरा हैरिस और डेनिएल मकाय करने के लिए विशेष रूप से ऋणी हैं. इस काम के लिए समर्थन जीवविज्ञान और कला और CWRU के विज्ञान के कॉलेज के विभाग द्वारा प्रदान की गई थी, और HHMI जैविक विज्ञान में स्नातक की शिक्षा के समर्थन के लिए अनुदान संख्या 52005866 से.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerin Jelly mounting media | Electron Microscopy Sciences | 17998-10 | Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997. |
| Zeiss LSM 700 Confocal | Carl Zeiss, Inc. | The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm). | |
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT) | |||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Glass cover slips | Electron Microscopy Sciences | 72204-02 | Size 1 ½ (specific for the objectives used in this work). |
| Glass cover slips (for making supports) | Fisher Scientific | 12-544-10 | Use four coverslips glued with superglue. |
| Dissection microscope | M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop | M420 | |
| Razor blade | Steel back single edge industrial blades | ||
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Hypodermic needles | Fisher Scientific | 1482610 | 26 Gauge |
| Pipettes | Labnet International |
References
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- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).
- Zander, R. H. On mounting delicate bryophytes in glycerol. The Bryologist. 100, 380-382 (1997).
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