Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

Summary

Intravitalmikroskopie zur zeitlichen und räumlichen hämodynamischen und entzündliche Ereignisse in der Pia Mikrozirkulation folgen.

Abstract

Dieses experimentelle Modell wurde entwickelt, um die Maus Pia Mikrozirkulation während der akuten und chronischen, physiologischen und pathophysiologischen hämodynamischen, Entzündungs-und Stoffwechselerkrankungen zu beurteilen, mit in vivo Fluoreszenz-Mikroskopie. Ein geschlossener Schädel-Fenster wird über den linken parieto-okzipitalen Kortex der Maus platziert. Lokale Mikrozirkulation wird in Echtzeit durch das Fenster mit epi-und Fluoreszenz-Beleuchtung und Messungen von Schiffen Durchmessern und roten Blutkörperchen (RBC) Geschwindigkeiten durchgeführt werden aufgezeichnet. RBC Geschwindigkeit gemessen mit real-time Kreuzkorrelation und / oder Fluoreszenz-markierten Erythrozyten. Leukozyten und Thrombozyten Einhaltung pialen Gefäße und Beurteilung der Perfusion und vaskuläre Leckage mit Hilfe der Fluoreszenz-markierten Marker wie Albumin-FITC und anti-CD45-Antikörper TxR gemacht. Mikrozirkulation kann wiederholt werden, über mehrere Tage auf Video aufgezeichnet. Wir haben zum ersten Mal die Fenster schließen Gehirn Intravitalmikroskopie der Pia Mikrozirkulation auf dynamische Veränderungen im Laufe des Plasmodium berghei ANKA-Infektion in Mäusen zu folgen und zeigen, dass die Expression von CM mit mikrozirkulatorischen Störungen durch Vasokonstriktion charakterisiert verbunden ist, starke Abnahme im Blut-Studie flow und schließlich Kreislaufkollaps.

Protocol

1. Kraniotomie

Ein Kraniotomie in 8-zu-10-Wochen alten Mäusen muss im Voraus, wie oben beschrieben ¹ durchgeführt werden, es sei denn, dass eine Titan-bar nicht in den Kopf des Tieres gelegt. Die chronische kranialen Fenster ist eine stabile Zubereitung ermöglicht Untersuchung der Pia Mikrozirkulation auch Monate nach der Implantation. In der Regel führen wir unsere Studien 2-3 Wochen nach der Schädelbasis Fenster Implantation.

2. Intravitalmikroskopie

1. Zwei bis drei Wochen nach der Kraniotomie, Körpertemperatur überprüft wird und dann die Maus leicht mit Isofluran (4% für die Induktion, 1-2% für die Wartung). Leichte Betäubung wird verwendet, um Tier Stress und Unbehagen während der experimentellen Verfahren zu verhindern.
2. Die Tiere werden dann in Bauchlage auf einem stereotaktischen Rahmen und der Kopf sorgfältig gesichert mit Ohr Bars. Die Höhe wird mit Hilfe des rechten und linken Hebel. Kerntemperatur des Körpers aufrechterhalten wird mit einem Heizkissen. Da Mäuse mit zerebraler Malaria zu entwickeln Hypothermie, müssen die Temperatur-Einstellungen für jedes Tier angepasst werden.
3. Das Deckglas auf dem kranialen Fenster ist vorsichtig mit einem Wattestäbchen mit Mineralöl und ein Panorama-Bild der Schiffe unter dem Fenster ist mit Hilfe von einem Stereomikroskop und einer Digitalkamera (Nikon Coolpix 995, Japan) entnommen befeuchtet gereinigt. Das Bild gedruckt ist, identifiziert und datiert und wird als eine Karte für die Messung von Gefäßdurchmesser und der roten Blutkörperchen (RBC) Geschwindigkeiten eingesetzt werden.
4. Die Maus wird dann zu einer intravitalen Mikroskoptisch (customized Leica-McBain, San Diego, CA) übertragen. Ein Tropfen Wasser auf den kranialen Fenster unter Ausnutzung der auch durch die zahnärztliche Acryl gebildet wird platziert, wird der Fokus eingestellt. Die Messungen werden mit einem 20-fach (LUMPFL-WIR, numerische Apertur 0,6, Olympus) Wasserimmersionsobjektiv durchgeführt. Das gleiche Gefäße, so dass direkte Vergleiche zu ihren Ausgangswerten durchgeführt werden konnte und so für mehr robust Statistiken für kleine Stichprobe der Bevölkerung, gefolgt. Die Bilder werden mit einer digitalen schwachem Licht Hochgeschwindigkeitskamera (Hamamatsu C9300-221, Japan), oder zu wenig Licht analoge Kamera (COHU 4815, San Diego, CA) verbunden mit einem Videoband (JVC, Japan), Uhrzeit (Microimage Video Systems, Boyertown, PA) und einem Farbmonitor (PELCO, Clovis, CA). Das Band ist richtig, bevor die Aufnahme beginnt identifiziert, und die Zeitstempel ermöglicht die Identifizierung der Ereignisse durch die Dokumentation der Zeitrahmen, in dem diese Ereignisse wurden umkodiert.
5. Eine erste Überprüfung der Schiffe wird, um die Qualität der Vorbereitung zu bewerten und, wenn das Blut ist in allen Gefäßen fließt. Dann ist die Auswahl der Gefäße gemessen werden gemacht und es sollte Venolen und Arteriolen mit unterschiedlichen Durchmessern (in unserer Maus Pia Vorbereitungen, Reichweite die meisten Schiffe zwischen 20 und 80 um) gehören und decken verschiedene Standorte innerhalb des durch das Fenster ausgesetzt. Arteriolen und Venolen können einfach, indem Sie die Richtung des Blutflusses in die Verästelungen des Schiffes (ob es oder vertreibt sammelt Blut) unterschieden werden. In unseren Studien werden die Messungen in 12 Schiffen. Die genaue Lage der einzelnen Stelle zu messen ist, kommentierten in das Bild des Pia-Gefäße.
6. Für jeden Punkt, ist der Gefäßdurchmesser gemessen unter Verwendung eines Bildes Scher-Gerät (Bild Shear, Vista Electronics, San Diego, CA) ^2. Sobald die Stelle ausgewählt wurde, wird das Bild des Schiffes in senkrechte Position ausgerichtet und das Bild wird geschert, bis der Gegensatz Extreme ausgerichtet sind und das Lesen wird dokumentiert. Dieser Wert kann in Mikrometer durch vorherige Kalibrierung für jede spezifische Vergrößerung mit einem Absehen Calibration Tischmikrometer (Edmund Optics Inc., Barrington, NJ) übersetzt werden.
7. Jeder Spot wird während mindestens 30 Sekunden für Erythrozyten-Tracking aufgezeichnet. Für Tracking ist eine Blutprobe erhoben und Erythrozyten sind fluoreszierend mit markierten die Carbocyanin Farbstoff Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) und infundiert über die Schwanzvene einer in vivo-Konzentration von ~ 0,4-0,5% ^{3 zu} erhalten. Bei Tieren mit Plasmodium berghei ANKA (PbA) Expression des grün fluoreszierenden Proteins (PBA-GFP, eine Spende der Malaria Forschung und Referenzreagens Resource Center MR4, Manassas, VA; von CJ Janse und AP Waters hinterlegt) infiziert, keine Infusion von markiertem Zelle notwendig ist. Die Videobilder werden bei 150 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet. Dieser Zinssatz soll auf 1-6 Bilder von einer Zelle auf einem Video-Frame für die Bestimmung der Geschwindigkeiten zu erhalten, um 8 mm / s. Die Videobilder werden mit einem Personal Computer mit Adobe Premier 4.0 Software digitalisiert und xy-Koordinatensystem für jede Zelle Bildes unter Verwendung SigmaScan Pro 4.0-Software (SPSS Chicago, IL) ^4. Zell-Positionen sind manuell und nicht durch Bildanalyse ermittelt, da das Auge eines geschulten Beobachters gezeigt wurde, um eine gute Einschätzung der Lage der Mitte einer Zelle, die gebenh in der Regel entspricht der Position der maximalen Fluoreszenz für die meisten Zellen Orientierungen beobachtet. Mehrere Bestimmungen der Position und Geschwindigkeit sind für jede Zelle hergestellt und gemittelt, um meine RBC Geschwindigkeit zu erhalten.
8. Wenn RBC Geschwindigkeitsmessungen offline durchgeführt werden, wird die gesamte Beobachtungszeit für jede Maus nicht überschreiten 10-15 Minuten Minimierung der cardiodepressive Auswirkungen der Narkose.
9. Sobald Gefäßdurchmesser und RBC Geschwindigkeitsmessungen verfügbar sind, die Berechnung des Blutflusses in jedes Schiff kann mit der Formel vorgenommen werden: Q = V x π (D / ²⁾ 2, wobei Q = Blutfluss, V = RBC Geschwindigkeit und D = Gefäßdurchmesser.
10. Diese Verfahren können im Laufe der Zeit wiederholt werden. Zum Beispiel, in dem Mausmodell der cerebralen Malaria führen wir tägliche Messungen, beginnend am Tag 4 der Infektion. Die erhaltenen Werte jeden Tag für jede Maus sind in Bezug auf Tag 0 (vor der Infektion), die als 100% normiert.
11. Neben Gefäßdurchmesser und Blutfluss Messungen können weitere Auswertungen vorgenommen, zum Beispiel eine verbesserte Beurteilung der Perfusion und der Analyse der Leukozyten-und / oder Thrombozyten-Rollen und die Einhaltung in Pia-Schiffe sein. Diese Messungen werden mit Hilfe der Fluoreszenz-markierten Marker durchgeführt. Im Fall von Malaria, können wir auch erkennen, Umluft-oder anhaftenden Parasiten durch den Einsatz der PBA-Stamm, GFP zum Ausdruck bringt.
12. Für Perfusion Beurteilung verwenden wir eine Lösung von FITC-markiertem Albumin (Sigma, St Louis, MO 50μg/mouse), und Leukozytenadhärenz zu Pia Schiffe verwenden wir Antikörper gegen die pan-Leukozyten-Marker CD45 mit Texas Red (TxR) gekennzeichnet quantifizieren ( Invitrogen, Carlsbad, CA 4μg/mouse). Dazu 25 &mgr; l des Albumin-FITC (2mg/mL) und 20 &mgr; l der anti-CD45-PE Antikörper (200μg/mL) werden gemischt und injiziert in den vorgewärmten Schwanzvene. Die Maus kann dann sofort abgebildet werden, wenn Leckmessungen dauert Albumin-FITC erlaubt wird, für 15 Minuten zirkulieren. Grüne Fluoreszenz (518nm) durch Albumin-FITC und GFP (PBA-GFP PRBC) emittiert wird gefangen genommen und mit ALPHA Vivid: XF100-2 (Omega Optical, Brattleboro, VT), und anti-CD45-TxR Fluoreszenz (615nm) ist beendet und gefangen mit einem Vivid Standard: XF42.
13. Die Fluoreszenz-markierten Albumin ermöglicht eine verbesserte Visualisierung der Gefäßnetz, einschließlich eindringende Schiffe, und es ist besonders nützlich in Krankheiten wie zerebrale Malaria für nicht-durchblutete oder unter durchbluteten Gefäßen zu überprüfen. Es kann auch verwendet werden, um vaskuläre Leckage ⁵ messen werden.
14. Die Fluoreszenz-markierten anti-CD45 Antikörper machen es leicht zu identifizieren und zu quantifizieren, Leukozyten-Rolling und die Adhäsion an Pia Schiffe. Zur Vermeidung von Verzerrungen bei der Quantifizierung, quantifizieren wir rollen und Haftung in den gleichen Stellen vordefinierte, um den Blutfluss zu messen. Die Quantifizierung der Adhäsion von Leukozyten wird durch Zählen der Anzahl der Leukozyten in einem 100 um-Schiff Länge. Rollende wird durch Zählen der Anzahl der Leukozyten reisen mit einer Geschwindigkeit deutlich langsamer als Blutflussgeschwindigkeit in der gleichen Länge 100 um, während 30 Sekunden quantifiziert.

3. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. (Schritt 2,6) Bilder von der Maus Pia Gefäßnetz zugänglich durch die kraniale Fenster.

Abbildung 2. (Schritte von 3,1 bis 3,5) Schematische Darstellung des Aufbaus für die Intravitalmikroskopie der Maus Pia Mikrozirkulation. 1: Intravitalmikroskopie Mikroskop; 2: 20X Wasserimmersionsobjektiv; 3: Lichtquelle; 4a: digitale Low-Light-High-Speed-Kamera, 4b: Analog-Kamera, 5: Maus in der stereotaktischen Rahmen, 6: Computer-Monitor, 7: Analog Shearer Monitor zeigt, wie das Bild Scherung (Pfeil) getan wird, um Gefäßdurchmesser zu messen.

Abbildung 3. (Step 3,6-3,8) Microvascular roten Blutkörperchen Geschwindigkeitsmessungen durch Zell-Tracking von High-Speed-Fluoreszenz-Videoaufnahmen. Bilder von A bis F sind Folge Bilder von einem Pia Schiff, zeigt ein einziges bewegliches RBC über den mikroskopischen Bereich begrenzt durch die Kamera. Manuelle Bestimmung von Frame für Frame-Positionen von 15 oder mehr Zellen über das Feld, mit seinen vorkalibrierten Distanz, ermöglicht die Berechnung der mittleren RBC Geschwindigkeit in jedes Schiff mit Hilfe einer Excel-Tabelle.

Abbildung 4. (Schritt 3,9) Daten eines repräsentativen Experiments zeigt die Veränderungen in Pia Blutfluss im Laufe der Zeit in Plasmodium berghei ANKA (PbA) infizierten Mäusen (n = 5) und in infizierten Mäusen der Kontrollgruppe (n = 5). Während in den Kontroll-Mäusen Pia Blutfluss im Zeitverlauf relativ stabil, zeigen PBA-infizierten Mäusen eine deutliche Abnahme des Blutflusseszum Zeitpunkt der zerebralen Malaria Entwicklung (Tag 6). Daten sind der Mittelwert ± SEM.

Abbildung 5. (Schritt 4,3) Eine große Zahl von Leukozyten adhärent Pia Schiffe mit einer Maus mit Plasmodium berghei ANKA infiziert, wie durch Färbung mit anti-CD45-Texas Red fluoreszierenden Antikörpern offenbart.

Discussion

Die Intravitalmikroskopie hier beschriebene Methode bietet eine einzigartige und leistungsstarke Werkzeug für die detaillierte Beobachtung der Pia Mikrozirkulation in der Maus. Es ermöglicht Aussonderung einzelner Arteriolen und Venolen und Messung von Veränderungen einer Reihe von Parametern wie Gefäßdurchmesser, RBC Geschwindigkeiten, die Durchblutung, die Einhaltung und Rollen der Leukozyten, Thrombozyten und andere Blut-Elemente, vaskuläre Leckage-, Gewebe-pH und pO2 und möglicherweise viele andere Anwendungen. Die in vivo vaskuläre Reaktion kann unverzüglich nach Interventionen wie Drug Administration evaluiert werden, oder bei pathologischen Prozessen. Darüber hinaus kann die Mikrozirkulation Verhalten dynamisch folgen im Laufe der Zeit. Wir haben diese Technologie verwendet, um die pialen Mikrozirkulation Veränderungen während der cerebralen Malaria durch P. verursacht Studie berghei ANKA in der Maus, und haben gezeigt, dass die neurologische Syndrom in dieses Modell mit einem Mikrozirkulation Dysfunktion durch reduzierte Hirndurchblutung, Vasokonstriktion, beeinträchtigt Perfusion und schließlich Kreislaufkollaps ⁶ gekennzeichnet assoziiert ist.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter Internationl Inc.	FDG9623
Carbocyanine dye Dil	Molecular Probes, Life Technologies	D306
Albumin-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Anti-CD45-TxR Ab	Invitrogen	MCD4517
P. berghei ANKA-GFP	MR4	MRA-865