Summary
pial 엑기스의 시간적 및 공간적 hemodynamic 및 염증성 이벤트를 따라 Intravital 현미경.
Abstract
이 실험 모델은 생체내 형광 현미경을 사용하여, 급성과 만성, 생리학 및 pathophysiological hemodynamic, 염증 및 대사 조건 중에 마우스 pial 엑기스를 평가하도록 설계되었습니다. 폐쇄 두개골 창이 생쥐의 왼쪽 parieto - 후두 피질을 통해 배치됩니다. 지역 엑기스는 에피와 형광 조명하고, 혈관의 직경 및 적혈구 세포 (RBC) 판매율이 수행되는 측정을 사용하여 창문을 통해 실시간으로 기록됩니다. RBC 속도는 실시간 상호 상관 및 / 또는 형광 라벨이 표시된 적혈구를 사용하여 측정됩니다. 재관류과 혈관 누출의 pial 선박 및 평가 백혈구와 혈소판 준수는 그러한 알부민 - FITC 및 안티 CD45 - TxR 항체로 형광 라벨이 표시된 마커의 도움으로 만들어집니다. 엑기스 반복 며칠 동안 비디오 녹화하실 수 있습니다. 우리는 처음으로 생쥐에서 Plasmodium berghei 앙카 감염의 과정 동안 역동적인 변화를 따라 CM의 표현이 혈액에 깊은 감소, vasoconstriction의 특징 microcirculatory 기능 장애와 관련된 것을 보여주기 위해 pial 엑기스를 연구하기 위해 창 닫기 두뇌 intravital 현미경에 사용 흐름과 혈관 결국 붕괴.
Protocol
1. Craniotomy
8 대 10 주 된 생쥐의 craniotomy은 티타늄 바에는 동물의 머리에 배치 아니라는 것을 제외하고, 이전에 설명한 1로 사전에 수행되어야합니다. 만성 두개골 창문조차 개월 이식 후에 pial 엑기스의 안정적인 준비 있도록 시험입니다. 보통, 우리는 2-3 주 두개골 창 주입 후 우리의 연구를 수행합니다.
2. Intravital 현미경
- 두 - 3 주 craniotomy 후 체온을 선택한 다음 마우스로 가볍게 anesthetized입니다 isoflurane (유도 4 %, 유지 보수 1-2 %). 라이트 마취는 실험 절차를 수행하는 동안 동물의 스트레스와 불편을 방지하는 데 사용됩니다.
- 동물은 다음 stereotaxic 프레임과주의 깊게 귀 막대를 사용하여 보안 머리에 발생하기 쉬운 위치에 배치됩니다. 수준은 오른쪽과 왼쪽 레버를 사용하여 조정됩니다. 핵심 체온은 가열 패드를 사용하여 유지됩니다. 대뇌 말라리아와 쥐가 저체온증을 개발하기 때문에, 온도 설정은 각각의 동물에 따라 조정해야합니다.
- 두개골 창문에 커버 슬립이 부드럽게 면봉은 광유와 창 아래에있는 혈관의 파노라마 사진이 stereomicroscope과 디지털 카메라 (니콘 Coolpix 995, 일본)의 도움으로 가져옵니다과 moistened 목화와 함께 청소합니다. 사진은 인쇄를 식별하고 날짜와 혈관 직경과 적혈구 세포 (RBC) 판매율의 측정을위한지도로 사용하게됩니다.
- 마우스는 다음 intravital 현미경 스테이지 (Leica - 맥베인, 샌디에고, CA 맞춤)로 전송됩니다. 물방울이 잘 치과 아크릴로 만들어 활용 두개골 창에 위치, 초점이 조정됩니다. 측정은 20X (LUMPFL - WIR, 수치 조리개 0.6, 올림푸스) 물 침지 목표를 사용하여 수행됩니다. 같은 혈관들은 기본 레벨로 직접 비교가 작은 샘플 집단에 대한 더 강력한 통계있게 수행될 수 있도록 다음 있습니다. 이미지는 디지털 낮은 광 고속 카메라 (하마 마츠 C9300 - 221, 일본) 또는 VCR 테이프에 연결된 낮은 광 아날로그 카메라 (COHU 4815, 샌디에고, CA) (JVC, 일본), 스탬프 시간 (MicroImage 비디오를 사용하여 캡처되어 시스템, 보여 타운, PA) 및 컬러 모니터 (PELCO, 클로 비스, CA). 테이프가 제대로 기록 시작하기 전에 식별하고 타임 스탬프는 이벤트 recoded되었던 동안 기간을 문서화하여 이벤트의 식별을 허용합니다.
- 혈관의 첫 번째 검사 혈액은 모든 혈관에 흐르는 경우 준비의 품질을 평가하기 위해 만든 것입니다. 그런 다음, 측정하는 혈관의 선택 사항이 있으며, 그것은 서로 다른 직경의 venules과 arterioles을 (우리가 마우스를 pial 준비에서, 대부분의 선박은 20 80μm 사이의 범위) 포함하고 창을에 의해 노출되는 영역 내에서 서로 다른 위치를 커버한다. Arterioles과 venules 쉽게 선박의 파급 효과에 혈액 흐름 (이것은 배포 또는 혈액을 수집 여부)의 방향을 선택하여 구분하실 수 있습니다. 우리의 연구에서 측정 12 혈관에서 만들어집니다. 측정 각 지점의 정확한 위치는 pial vasculature의 그림에 주석이있다.
- 각 지점은 혈관의 직경은 이미지 전단 장치 (이미지 쉬어, 비스타 전자, 샌디에고, CA) 2를 사용하여 측정됩니다. 장소가 선택되면, 선박의 이미지가 수직 위치에 정렬되고 반대 극단이 정렬되고 읽기가 문서화 때까지 이미지가 가지각색입니다. 이 값은 십자선 보정 스테이지 마이크로 미터 (에드먼드 광학 주식 회사, 배링턴, NJ)를 사용하여 각 특정 배율의 이전 교정하여 micrometers로 번역하실 수 있습니다.
- 각 지점은 적혈구 추적 적어도 30 초 동안 기록됩니다. 추적, 혈액 샘플을 수집하고, 적혈구는 찬란로 표시하는 염료 Dil (분자 프로브, 칼스 배드, CA)와 ~ 0.4-0.5 % 3의 생체내 농도를 얻기 위해 꼬리 정맥을 통해 주입을 carbocyanine. , 레이블없이 주입, Plasmodium berghei 앙카 (PBA)는 녹색 형광 단백질 (CJ Janse와 AP 워터스에 의해 입금 PBA - GFP, 말라리아 연구 및 참조 시약 리소스 센터 MR4, 머내서스, VA에서 기부금을) 표현에 감염된 동물 세포가 필요합니다. 영상은 초당 150 프레임에 기록됩니다. 이 요금은 8mm / s의 최대 판매율의 결정에 대해 하나의 비디오 프레임에 셀 1-6 이미지를 얻을로 설정되어 있습니다 비디오 이미지는 어도비 프리미어 4.0 소프트웨어를 사용하여 개인용 컴퓨터와 디지털 있으며, 각 셀에 이미지를위한 XY 좌표 데이터는 SigmaScan 프로 4.0 소프트웨어 (SPSS 시카고, IL) 4를 사용하여 얻을 수 있습니다. 셀 위치는 훈련 관찰자의 눈이되는 세포의 중심의 위치의 좋은 평가를 제공 표시된 것을 감안할 때, 이미지를 분석하여 수동보다는 결정됩니다일반적으로 H는 대부분의 세포 오리 엔테이션에 대한 관찰 최대한의 형광의 위치에 해당합니다. 위치와 속도의 다중 결정은 각 셀에 대해 만든 의미 RBC 속도를 얻기 위해 평균입니다.
- RBC 속도 측정이 오프라인 수행하는 경우, 각각의 마우스에 대한 총 관측 시간은 마취의 cardiodepressive 효과를 최소화 10-15분를 초과하지 않습니다.
- 혈관 직경과 RBC 속도 측정을 사용할 수 있습니다되면, 각 선박의 혈액 흐름의 계산 공식을 사용하여 만들 수 있습니다 : Q = V X π (D / 2) 2, 어디서 Q = 혈액의 흐름, V = RBC 속도와 D = 혈관 직경.
- 이러한 절차는 시간이 지남에 따라 반복 수 있습니다. 예를 들어, 뇌성 말라리아의 마우스 모델에서, 우리는 감염 4 일 시작하는 매일 측정을 수행합니다. 각각의 마우스에 대한 매일 얻은 값은 100 %로 간주됩니다 일 0 관계 (예정 감염)에 정규화합니다.
- 혈관 직경과 혈류 측정 이외에 추가적인 평가는 인스턴스 개선 재관류의 평가 및 pial 혈관에 백혈구 및 / 또는 혈소판 압연 및 준수의 분석을 위해, 수행할 수 있습니다. 이러한 측정은 형광 라벨이 표시된 마커의 도움으로 수행됩니다. 말라리아의 경우, 우리는 또한 GFP를 표현 PBA의 변형을 사용하는 방법으로 순환하거나 자기편 기생충를 검색할 수 있습니다.
- 재관류 평가에 대한 우리의 솔루션을 사용 FITC - 표시된 (시그마, 세인트 루이스, MO 50μg/mouse) 알부민, 그리고 우리가 텍사스 레드 (TxR)로 표시된 팬 백혈구 마커 CD45에 대한 항체를 사용 pial 선박 백혈구 준수를 수치 ( Invitrogen, 칼스 배드, CA 4μg/mouse). 이 경우, 알부민 - FITC (2mg/mL) 및 안티 CD45 - PE 항체의 20μL가 (200μg/mL) 혼합 및 사전 예열 꼬리 정맥에 주사의 25μL. 누설 측정 알부민 - FITC가 15 분 동안 순환을 허용 소요됩니다 경우 마우스 그러면하지만, 바로 몇 군데 있습니다. XF100 - 2 (오메가 광학, 브레 틀 보로, VT), 및 안티 CD45 - TxR 형광이 (615nm) 종료하고 있습니다 : 알부민 - FITC와 GFP (PBA - GFP pRBC)에 의해 방출 그린 형광 (518nm)를 사용 비비드 ALPHA 캡처입니다 XF42 : 비비드 표준 캡처.
- 형광 - 라벨 알부민은 관통 선박을 포함하여 혈관 네트워크의 향상된 시각화를 허용하고, 이러한 비 perfused 이하 - perfused 선박에 대한 확인 뇌성 말라리아와 같은 질병 상태에 특히 유용합니다. 또한 혈관 누출 5 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
- 형광 라벨이 표시된 안티 CD45 항체는 pial 선박 백혈구 압연과 접착력을 식별하고 계량 쉽게합니다. 부량의 편견을 피하기 위해, 우리는 동일한 반점 혈액 흐름을 측정하기 위해 사전에 정의된 압연과 접착력을 계량. 백혈구 유착의 부량는 100μm - 선박 길이 leukocytes의 수를 계산하여 이루어집니다. 롤링은 30 초 동안 같은 100μm 길이가 혈액 속도보다 훨씬 느린 속도로 움직이고 leukocytes의 수를 계산하여 계량입니다.
3. 대표 결과
그림 1. 두개골 창을 통해 액세스할 마우스 pial 혈관 네트워크 (단계 2.6) 사진.
그림 2. 마우스 pial 엑기스의 intravital 현미경을위한 세트 (단계 3.1-3.5) 도식 디스플레이까지. 1 : intravital 현미경, 2 : 20X 물 침지 목표, 3 : 광원, 4A : 디지털 낮은 광 고속 카메라, 4B : 아날로그 카메라, 5 stereotaxic 프레임에 마우스, 6 : 컴퓨터 모니터, 7 : 아날로그 시어러 이미지 전단 (화살표)가 혈관 직경을 측정하기위한 것입니다 방법을 보여주는 모니터.
그림 3. 고속 형광 영상 레코딩에서 세포 추적하여 (단계 3.6-3.8) Microvascular 적혈구 세포 속도 측정. F에 사진은 카메라에 의해 미세한 구분된 필드를 건너 하나의 움직이는 RBC를 보여주는 한 pial 선박의 시퀀스 이미지입니다. 의 사전 조정 거리와 필드를 건너 15 인 이상 세포의 프레임 위치로 프레임의 수동 결정은 Excel 스프레드 시트의 도움으로 각 선박에 의미 RBC 속도의 계산을 수 있습니다.
그림 4. Plasmodium berghei 앙카 (PBA) 감염된 생쥐 (n은 = 5) 시간이 지남에와 감염되지 않은 컨트롤 마우스의 pial 혈액 흐름의 변화를 보여주는 대표적인 실험 (단계 3.9) 데이터 (n은 = 5). 컨트롤 마우스의 pial 혈액 흐름이 시간이 지남에 따라 상대적으로 안정 반면, PBA에 감염된 마우스는 혈액의 흐름에 표시된 감소를 보여대뇌 말라리아 개발 (6 일)의 시간에. 데이터는 평균 ± SEM 있습니다.
그림 5. Plasmodium berghei 앙카에 감염된 마우스의 pial 선박 자기편 leukocytes의 (단계 4.3) 다수의 같은 반 CD45 - 텍사스 레드 형광 항체와 얼룩으로 나타났다.
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Discussion
여기에서 설명한 intravital 현미경 메서드는 마우스의 pial 엑기스에 대한 자세한 관찰을위한 독특하고 강력한 도구를 제공합니다. 그것은 다른 개인 arterioles 및 venules 뽑아 내서와 같은 혈관 직경, RBC의 판매율, 혈액의 흐름, 준수 및 leukocytes, 혈소판 및 기타 혈액 요소, 혈관 누출, 조직 산도와 pO2의 압연과 같은 매개 변수의 개수의 변화를 측정 수 있으며 잠재적으로 여러 응용 프로그램입니다. 생체내 혈관 반응은 신속 같은 약물 관리 등 중재에 따라 평가, 또는 병적인 과정 동안 수 있습니다. 또한, microcirculatory 동작은 동적으로 시간이 지남에 따라 최대 수 있습니다. 우리는 P.으로 인한 뇌성 말라리아 동안 pial microcirculatory 변화를 연구하기 위해이 기술을 사용한 berghei 마우스에 앙카, 그리고이 모델의 신경 증후군이 감소 대뇌 혈류, vasoconstriction, 장애인 재관류 결국 혈관 붕괴 6 특징 microcirculatory 장애와 연관된 것으로 나타났습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 LJMC으로 국립 보건원에서 보조금 R01 - HL87290, R01 - HL87290 - S1과 R01 - AI082610에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Baxter Internationl Inc. | FDG9623 | |
| Carbocyanine dye Dil | Molecular Probes, Life Technologies | D306 | |
| Albumin-FITC | Sigma-Aldrich | A9771 | |
| Anti-CD45-TxR Ab | Invitrogen | MCD4517 | |
| P. berghei ANKA-GFP | MR4 | MRA-865 |
References
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