Microscopie intravitale de la microcirculation cérébrale souris en utilisant une fenêtre fermée crânienne

Summary

Microscopie intravitale à suivre spatiale et temporelle des événements hémodynamiques et inflammatoires dans la microcirculation piales.

Abstract

Ce modèle expérimental a été conçu pour évaluer la microcirculation souris piales cours aiguës et chroniques, hémodynamiques physiologiques et physiopathologiques, maladies inflammatoires et métaboliques, à l'aide de la microscopie par fluorescence in vivo. Une fenêtre fermée crânienne est placé sur la gauche du cortex pariéto-occipitale de la souris. Microcirculation locale est enregistrée en temps réel à travers la fenêtre en utilisant le PEV et d'illumination par fluorescence, et des mesures de diamètres des navires et des globules rouges (GR) les vitesses sont effectuées. Vitesse de RBC est mesurée à l'aide en temps réel de corrélation croisée et / ou érythrocytes marqués par fluorescence. L'adhésion leucocytaire et plaquettaire aux navires piales et l'évaluation de la perfusion et les fuites vasculaires sont faites avec l'aide de marqueurs marqué par fluorescence tels que les anticorps d'albumine-FITC et anti-CD45-TXR. Microcirculation peut être à plusieurs reprises enregistrées sur vidéo pendant plusieurs jours. Nous avons utilisé pour la première fois la microscopie intravitale fermer la fenêtre du cerveau pour étudier la microcirculation piales de suivre les changements dynamiques au cours de Plasmodium berghei ANKA l'infection chez la souris et montrent que l'expression de la CM est associée à des dysfonctionnements microcirculatoires caractérisé par une vasoconstriction, une diminution profonde dans le sang de flux et de l'effondrement à terme vasculaires.

Protocol

1. Craniotomie

Une craniotomie en 8 à 10 semaines des souris âgées doit être effectuée à l'avance comme ^une décrits précédemment, sauf que la barre de titane n'est pas placé à la tête de l'animal. La fenêtre chroniques crânienne est un examen permettant préparation stable de la microcirculation piales voire des mois après son implantation. Habituellement, nous effectuons nos études 2-3 semaines après l'implantation fenêtre crânienne.

2. Microscopie intravitale

1. Deux-trois semaines après la craniotomie, la température du corps est cochée, puis la souris est légèrement anesthésiés à l'isoflurane (4% pour l'induction, de 1-2% pour la maintenance). Anesthésie légère est utilisée pour prévenir le stress des animaux et de l'inconfort lors de la procédure expérimentale.
2. Les animaux sont ensuite placés en décubitus ventral sur un cadre stéréotaxique et la tête soigneusement sécurisés utilisant les barres d'oreille. Le niveau est ajusté en utilisant les leviers de droite et de gauche. Température centrale du corps est maintenue à l'aide d'un coussin chauffant. Parce que les souris avec le paludisme cérébral de développer l'hypothermie, les paramètres de température doivent être ajustés pour chaque animal.
3. La lamelle sur la fenêtre crânienne est légèrement nettoyé avec un coton-tige humidifié avec de l'huile minérale et une image panoramique sur les vaisseaux sous la fenêtre est pris avec l'aide d'un stéréomicroscope et d'un appareil photo numérique (Nikon Coolpix 995, Japon). La photo est imprimée, identifié et daté et sera utilisée comme une carte pour les mesures de diamètre du vaisseau et de globules rouges (RBC) vitesses.
4. La souris est alors transféré à une platine de microscope intravitale (personnalisés Leica-McBain, San Diego, Californie). Une goutte d'eau est placée sur la fenêtre crânienne profitant du puits formé par les acryliques dentaires, l'accent est ajustée. Les mesures sont effectuées en utilisant un objectif de l'eau 20X (LUMPFL-WIR, ouverture numérique 0,6, Olympus) d'immersion. Les mêmes navires sont suivis afin que les comparaisons directes à leur niveau de référence pourrait être effectuée permettant plus de statistiques robustes pour les populations petit échantillon. Les images sont capturées en utilisant un appareil photo numérique à faible vitesse de la lumière élevée (Hamamatsu C9300-221, Japon), ou à faible lumière caméra analogique (COHU 4815, San Diego, Californie) relié à une bande de magnétoscope (JVC, Japon), horodatés (Vidéo Microimage Systèmes, Boyertown, PA) et un écran couleur (Pelco, Clovis, Californie). Le ruban est correctement identifié avant le début de l'enregistrement, et l'horodatage permet d'identifier les événements en documentant la période pendant laquelle ces événements ont été recodé.
5. Une première vérification des vaisseaux est fait pour évaluer la qualité de la préparation et si le sang coule dans toutes les cuves. Ensuite, la sélection des navires devant être mesurée est faite et il devrait inclure des veinules et des artérioles de différents diamètres (dans nos préparatifs de souris piales, la plupart des navires varie entre 20 et 80μm) et couvrent différents endroits dans la zone exposée par la fenêtre. Artérioles et veinules peuvent être facilement différenciés par la vérification du sens du flux sanguin dans les ramifications de la cuve (si elle distribue ou collecte de sang). Dans nos études, les mesures sont effectuées dans les 12 navires. Repérage précis de chaque spot à mesurer est annoté dans le tableau de la vascularisation piales.
6. Pour chaque spot, le diamètre du vaisseau est mesuré en utilisant un dispositif de cisaillement d'image (image de cisaillement, Vista Electronics, San Diego, CA) ^2. Une fois que le spot est sélectionné, l'image du navire est aligné en position verticale et l'image est cisaillé jusqu'à des extrêmes opposés sont alignés et la lecture est documentée. Cette valeur peut être traduit en micromètres par étalonnage précédente pour chaque grossissement spécifique en utilisant un micromètre étalonnage Réticule scène (Edmund Optics Inc, Barrington, NJ).
7. Chaque spot est enregistrée pendant 30 secondes au moins pour le suivi des érythrocytes. Pour le suivi, sur un échantillon de sang est prélevé, et les érythrocytes sont marqués par fluorescence avec le colorant carbocyanine Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) et perfusée à travers la veine de la queue pour obtenir une concentration en vivo de ~ 0,4-0,5% ^3. Chez les animaux infectés par Plasmodium berghei ANKA (PBA), exprimant la protéine fluorescente verte (GFP PBA-, un don de la recherche sur le paludisme et la référence réactif Centre de ressources MR4, Manassas, en Virginie, déposé par CJ Janse et AP-Eaux), pas de perfusion d'étiquette cellulaire est nécessaire. Les images vidéo sont enregistrées à 150 images par seconde. Ce taux est fixé pour obtenir un six images d'une cellule sur une image vidéo pour la détermination des vitesses allant jusqu'à 8 mm / s. Les images vidéo sont numérisés avec un ordinateur personnel en utilisant Adobe Premier 4.0 du logiciel, et xy données de coordonnées pour chaque image de cellules sont obtenues en utilisant le logiciel Pro 4.0 SigmaScan (SPSS Chicago, IL) ^4. Positions cellulaire sont déterminés manuellement plutôt que par analyse d'image, étant donné que l'œil d'un observateur qualifié a été montré pour donner une bonne estimation de l'emplacement du centre d'une cellule, ce quih en général correspond à l'emplacement de la fluorescence maximale observée pour les orientations les plus cellulaires. Déterminations multiples de la position et la vitesse sont faites pour chaque cellule et moyenne afin d'obtenir la vitesse moyenne de RBC.
8. Lorsque des mesures de vitesse sont effectués hors de RBC, le temps total d'observation pour chaque souris ne dépasse pas 10-15 minutes en minimisant les effets cardiodépresseur de l'anesthésie.
9. Une fois le diamètre du vaisseau et les mesures de vitesse RBC sont disponibles, le calcul du débit sanguin dans chaque navire peut être faite en utilisant la formule suivante: Q = V x π (D / ²⁾ 2, où Q = le débit sanguin, V = vitesse de RBC et D = diamètre du vaisseau.
10. Ces procédures peuvent être répétées dans le temps. Par exemple, dans le modèle murin de neuropaludisme, nous effectuons des mesures quotidiennes à partir du jour 4 de l'infection. Les valeurs obtenues chaque jour pour chaque souris sont normalisés par rapport au jour 0 (pré-infection), qui est considéré être à 100%.
11. En plus de diamètre du vaisseau et les mesures du flux sanguin, des évaluations supplémentaires peuvent être effectuées, par exemple pour l'évaluation de l'amélioration de la perfusion et l'analyse des leucocytes roulant et / ou de plaquettes et l'adhérence dans les vaisseaux pie-mère. Ces mesures sont effectuées avec l'aide de marqueurs fluorescents marqués. Dans le cas du paludisme, nous pouvons également détecter ou de parasites circulant adhérentes par des moyens d'utiliser la souche PbA qui exprime la GFP.
12. Pour l'évaluation de la perfusion, nous utilisons une solution de FITC-albumine marquée (Sigma, St Louis, MO 50μg/mouse), et de quantifier l'adhérence des leucocytes aux navires piales nous utilisons des anticorps contre les marqueurs pan-leucocytaire CD45 marqués avec Texas Red (TxR) ( Invitrogen, Carlsbad, CA 4μg/mouse). Pour cela, 25 pi de l'albumine-FITC (2mg/mL) et 20 pi de l'anticorps anti-CD45-PE (200μg/mL) sont mélangés et injectés dans la veine de la queue préchauffé. La souris peut alors être visualisé immédiatement, toutefois, si des mesures de fuite se albumine-FITC est autorisé à circuler pendant 15 minutes. Fluorescence verte (518nm) émise par l'albumine-FITC et GFP (PBA-GFP CGR) est capturé à l'aide et ALPHA Vivid: XF100-2 (Omega Optical, Brattleboro, VT), et anti-CD45-TxR fluorescence (615nm) est sorti et capturées avec une norme Vivid: XF42.
13. L'albumine marqués par fluorescence permet une meilleure visualisation du réseau vasculaire, y compris les navires pénétrant, et il est particulièrement utile dans les états pathologiques tels que le paludisme cérébral pour vérifier pour les navires non perfusé ou sous-perfusées. Il peut également être utilisé pour mesurer les fuites vasculaires ^5.
14. La fluorescence des anticorps anti-CD45 rendent facile à identifier et à quantifier l'adhérence des leucocytes et des roulants à des navires piales. Pour éviter les biais dans la quantification, nous quantifions roulant et l'adhérence dans les mêmes endroits pré-définis pour mesurer le flux sanguin. Quantification de l'adhésion des leucocytes est faite par le comptage du nombre de leucocytes dans une longueur 100 microns-navire. Rolling est quantifiée par comptage du nombre de leucocytes circulant à une vitesse nettement plus lente que la vitesse du sang dans la même longueur 100 microns, pendant 30 secondes.

3. Les résultats représentatifs

Figure 1. (Étape 2.6) Photos du réseau vasculaire de la souris piales accessibles via la fenêtre crânienne.

Figure 2. (Étapes 3.1 à 3.5) affichent schématique de la mise en place pour la microscopie intravitale de la microcirculation souris piales. 1: Microscope intravitale; 2: 20X objectif à immersion d'eau; 3: source de lumière; 4a: numériques de faible éclairage caméra à grande vitesse; 4b: caméra analogique; 5: la souris dans le cadre stéréotaxique; 6: écran d'ordinateur; 7: analogiques Shearer suivre en montrant comment l'image de cisaillement (flèche) est fait pour mesurer le diamètre du vaisseau.

Figure 3. (Étape 3.6 à 3.8) microvasculaire rouges mesures globules vitesse par la cellule de suivi à partir d'enregistrements vidéo haute vitesse de fluorescence. Photos de A à F sont des images séquence d'un navire de piales, montrant un seul mouvement RBC traversant le champ délimité par la caméra microscopique. Détermination manuelle du cadre par des positions cadre de 15 ou plus de cellules traversant le terrain, avec sa distance pré-calibré, permet le calcul de RBC vitesse moyenne dans chaque récipient à l'aide d'un tableur Excel.

Figure 4. (Étape 3.9) Les données d'une expérience représentative montrant les modifications du débit sanguin dans le temps piales Plasmodium berghei ANKA (PBA) des souris infectées (n = 5) et chez les souris témoins non infectés (n = 5). Alors que chez les souris de contrôle de la circulation sanguine pial est relativement stable au fil du temps, la LRR souris infectées montrent une nette diminution du débit sanguinau moment du développement de la malaria cérébrale (jour 6). Les données sont la moyenne ± SEM.

Figure 5. (Étape 4.3) Un grand nombre de leucocytes adhérents aux navires piales de souris infectées par Plasmodium berghei ANKA, tel que révélé par coloration avec des anticorps anti-CD45-Rouge-Texas fluorescentes.

Discussion

La méthode décrite ici microscopie intravitale fournit un outil unique et puissant pour l'observation détaillée de la microcirculation piales chez la souris. Il permet singulariser artérioles et veinules individuels et de mesurer les changements d'un certain nombre de paramètres tels que diamètre des vaisseaux, des vitesses de RBC, le flux sanguin, l'adhérence et le laminage des leucocytes, des plaquettes et d'autres éléments du sang, des fuites vasculaires, le pH et pO2 tissus et potentiellement de nombreuses autres applications. La réponse vasculaire au vivo peuvent être rapidement évaluées lors des interventions telles que l'administration du médicament, ou lors de processus pathologiques. Par ailleurs, le comportement de la microcirculation peuvent être dynamiquement suivi dans le temps. Nous avons utilisé cette technologie pour étudier les changements microcirculatoires piales pendant la malaria cérébrale causée par P. berghei ANKA chez la souris, et ont montré que le syndrome neurologique, dans ce modèle est associé à une dysfonction microcirculatoire caractérisée par réduction du flux sanguin cérébral, la vasoconstriction, la perfusion avec facultés affaiblies et l'effondrement éventuellement vasculaires ^6.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter Internationl Inc.	FDG9623
Carbocyanine dye Dil	Molecular Probes, Life Technologies	D306
Albumin-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Anti-CD45-TxR Ab	Invitrogen	MCD4517
P. berghei ANKA-GFP	MR4	MRA-865