Summary
Biz ayrı primer hücrelerin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol
Abstract
Burada Drosophila gastrula embriyolar ayrı hazırlanması ve kültür birincil hücreler için bir yöntem açıklanmaktadır. Kısacası, büyük bir miktarı, genç ve sağlıklı bir sinek embriyolar sahnelenen, toplanan sterilize ve sonra bir cam Homojenizatör kullanarak tek bir hücre süspansiyonu içine fiziksel olarak ayrışmış. Kültür plakaları veya kültür ortamı uygun bir yoğunlukta odasına slaytlar kaplama olduktan sonra, bu hücreler daha fazla kendi özel hücre belirteçleri ile tespit edilebilir çeşitli morfolojik farklı hücre tipleri, ayırt edebilirsiniz. Ayrıca, çift zincirli (ds) RNA'lar gen demonte ortaya çıkarmak için bu hücrelerin tedavisi için şartlar mevcut. Drosophila primer hücrelerde Verimli RNAi dsRNA içeren kültür ortamında hücrelerin sadece banyo yapılır. Diğer moleküler, biyokimyasal, hücre görüntüleme analizleri ile birlikte, etkili RNAi pertürbasyon yürütmek için yeteneği, özellikle Drosophila birincil hücreler, farklılaşmış kas ve nöronal hücrelerin ilgili olanlar olarak cevaplandırılmak üzere çeşitli sorular sağlayacaktır.
Protocol
1. Sinek kafesleri hazırlanması
- Drosophila (Oregon-R ya da herhangi bir genotip gibi yabani tip suşlar), 32-oz böcek bardak gibi uygun kaplarda büyütün.
- Büyük embriyo toplama kafesleri Transfer yeni eclosed sinekler veya nüfus kafesleri uçmak.
- ~ 25 bir sıcaklık ile bir odaya kafesleri Taşı ° C ve nem ~ 65% 12 saatlik ışık ve senkron embriyoların toplanmasını kolaylaştırmak için, 12 saat karanlık bir döngüsü.
- Onlara pekmez plakalar üzerinde çizikler maya yapıştırın öldürdü beslenme kafeslerde sinekler koruyun. 2-3 günde bir kez pekmez levhalar (öldürüldü maya yapıştır ile) değiştirin d.
2. Senkron embriyo toplanması
- Birincil hücre hazırlık günü, 1-2 saat öncesi yatıyordu süre yapıştırın öldürüldü maya ile kaplı uçar wth taze plakaları beslenirler.
- Sadece 12 saat karanlık döngüsü önce, az miktarda maya hamur çizgili taze pekmez plakaları ile ön yatıyordu plakaları değiştirin. Asenkron büyük embriyoları içeren öncesi yatıyordu toplanması, atın.
- 1-2 saat bir süre için toplayın embriyolar
- 5-6 saat boyunca 25, embriyo ve mağaza nispeten senkron nüfus içeren plakalar ° C çıkarın Embriyolar bu zamanda, ileri gastrula aşamada olacak.
3. Toplama ve embriyo yıkama
- Embriyoların altındaki en güzel örgü elek toplamak, böylece, ıslak bir fırça ile plakalar embriyoların gevşetin ve yığılmış elekler ılık musluk suyu ile iyice durulayın. Mümkün olduğu kadar çok maya ve sinek enkaz kaldırmak için bir kaç dakika durulayın.
- İpucu embriyoların bir tarafında birikir elekler ve bir dechorionation sepet içine yavaşça elek onları yıkayın.
- Embriyoların kurumasına izin vermeden doku kültürü kaputu alana taşıyın.
4. Embriyo hücrelerinin Homojenizasyon ve kaplama
- Sterilize ve embriyoların% 50 (hacim / hacim) 5-10 dakika çamaşır suyu çeker dechorionate. Sepet duvardan embriyoların% 70 (hacim / hacim) etanol ile durulayın. Alternatif olarak, etanol tedavi öncesi, distile su ile çamaşır suyu embriyolar kapalı yıkayın. Bu noktadan itibaren embriyolar steril şartlarda ve doku kültürü kaputu içinde ele alınmalıdır.
- Otoklavlanmış distile su ile çamaşır suyu ve / veya etanol kaldırmak için embriyoların iyice durulayın.
- Dechorionation adım sırasında, embriyoların miktarına göre oda sıcaklığında M3 orta uygun hacmi ile Dounce Homojenizatör doldurun. Embriyo ve medya hacmi arasındaki oranı 0.5 ml embriyolar üzerinde olmamalı: 40 ml medya (veya ~ 100-200 embriyolar / ml).
- Batığın embriyoların M3 medya için yeterli miktarda steril bir beher durulanır embriyolar yerleştirin. Embriyolar 2-5 dakika bekletin edelim.
- Dechorionation sepeti sökün ve Nitex örgü kuru steril kağıt havlu ile kurulayın.
- Homojenizatör embriyolar steril bir fırça ile aktarın.
- Tüpün alt ulaşmadan tüm embriyolar askıya alınır kadar gevşek bir havaneli kullanarak kısa vuruş ile hafifçe karıştırılır. Sonra kibarca ama kesin bir tavırla, tam sekiz vuruş ile homojenize. Aşağı yukarı doğru hareket eder ve havaneli bükmeyin.
- 50 ml steril konik santrifüj tüpü içine dökme veya pipetleme ya Homojenat transfer ve tüp kap.
- 40g, pelet oda sıcaklığında doku artıkları, büyük hücre kümeleri ve vitelline membranlar 10 dakika santrifüjleyin. Temiz bir tüp hücreleri ve yumurta sarısı içeren süpernatant aktarın ve 5 dakika süreyle santrifüj adımı tekrarlayın.
- Hücreler dökülerek veya pelet, 360g oda sıcaklığında 10 dakika için temiz bir tüp ve spin pipetleme süpernatantı dikkatlice aktarın. Süpernatantı atın. 10 ml kültür ortamı hücre pelet (RNAi deneyler için serum orta) tekrar
- Hücre yoğunluğunu tahmin etmek için bir hemasitometre kullanarak canlı hücreler güvenin. Bu arada, pelet hücreleri 4.10 adımı tekrarlayın.
- Istenen konsantrasyon hücreleri yeniden süspanse edin. Başlatmak için, bir dizi 1 ~ 5 x10 6 hücre / ml ve 1,7 - 2,5 x10 5 hücre / cm 2 plaka deneyin .
5. 384 plaka yetiştirilen hücreler için İlköğretim-hücre RNAi
- ~ 250 ng 384 plaka de ortalama bir final konsantrasyonda her kuyuya dsRNAs 5 ul koyun.
- Çok kanallı pipet kullanın, 10 ml (1 ~ 4x106 hücre / ml) 384-plaka her yanı farklı bir dsRNA içeren bir serum serbest M3 orta başına birincil hücreler dağıtmak. Alternatif olarak, hücre konfokal görüntüleme için 8-iyi cam oda slaytlar üzerinde yetiştirilebilir.
- 300g oda sıcaklığında 1 dakika süreyle plakaları santrifüjleyin. 25 serum orta Kültür hücreleri ° C 22 saat veya 18 ° C 1-2 d.
- Her bir kuyunun 30 ml serum içeren kültür ortamı ekleyin. 300g oda sıcaklığında 1 dakika süreyle plakaları santrifüjleyin.
- ~ 7 gün 25 nemli bir ek 5 odası ve kültürü birincil hücreler ° C tabak koyun
- Resim hücreleri ya canlı ya da immünofloresan boyama sonra.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
En uygun koşullarda, kültür hücreleri yuvarlak bir morfoloji sağlıklı görünecektir. Kültür küçük hücre artıkları ve ilk kaplama sonra 50 ~% 80 birleşmiş olacak. Bu hücreler, uzun bir süre için kültür sonra morfolojik değişikliklere uğrayacaktır. Genellikle tam 25 farklı kültür hücreleri için yaklaşık 5-8 gün sürer ° C İyi kalite primer kültürlerinde genellikle hücrelerin-faiz kültürü ne kadar iyi ayırt tarafından değerlendirilecektir. Örneğin, birincil kas hücreleri genellikle bir dal gibi morfoloji ve multinükleer myotubes myofibrils gibi bir dizi sarcomeres oluşan şerit haline. Tamamen farklılaşmış myotubes kültüründe genellikle kendiliğinden hareket eder. Buna karşılık, farklı birincil nöronların hücre gövdeleri ile kümeler oluştururlar ve akson kabloları ile diğer kümeler ile bağlantı.
Şekil 1. Birincil hücre kültür kaplama sonra morfolojik değişikliklere uğrarlar
Birincil hücreler (A) 384 plaka iyi sağ kaplama edildikten sonra parlak bir alan görüntü. Hücrelerin büyük çoğunluğu yuvarlak ve sağlam ve çok iyi ayrılmış. (B) Primer hücre kültürü parlak bir alan görüntü kaplama 20 saat sonra. İlköğretim hücreleri zaten bir şube gibi morfolojisi (uzun ok) kümeleri (büyük ok ucu) ve kaslar bu aşamada kabul edilebilir oluşturur. (C) primer kültür kaplama 5 gün sonra faz-kontrast görüntü. Kültür nöronal uzantıları (küçük oklar), nöron kümeleri (büyük ok başları) ve kasları (orta ölçekli ok), çok daha gelişmiş görünüyor.
Şekil 2. 384 plaka kültür dsRNAs ile tedavi birincil hücre örnekleri
İlköğretim Dmef2-Gal4 taşıyan embriyolar, D42-Gal4 UAS-mito-GFP transgenlerin, hangi Dmef2 Gal4 ve kasları ve motor nöronlar mito-GFP D42-Gal4 sürücü ifadesi, sırasıyla hücreleri izole edildi. Hücreler lacZ (AC) veya şişirilmiş (eğer varsa) (DF) ya da hedef dsRNAs ile tedavi edildi. Birincil kas ve nöronların her ikisi de, GFP (A, C, D, F) tarafından görülebilir. Nöronal uzantıları beyaz oklar. Aktin (ok başları) Phalloidin boyama, kültür lacZ dsRNAs (B ve C) ile tedavi edilen bir şube gibi kas yapısı ortaya, ancak kültür yuvarlak kas morfoloji eğer tedavi dsRNAs (E ve F). Birleştirilen görüntülerin (C, F), kasları sarı lekeli, ama kırmızı negatif gösterir nöronlar ve onların uzantıları (beyaz oklar).
Şekil 3. Insan vitronectin kaplı kapak cam slaytlar kültüre birincil kasların Konfokal mikrograflar
İlköğretim kasları immunofluorescently anti-Drosophila Titin (KZ) (birleştirme kırmızı) ve aktin için Phalloidin (birleştirme yeşil) ile boyandı. Üst paneller, vahşi-tip kontrol kas ve alt olanlar sals (CG31374) kısaltılmış sarcomeres RNAi kas vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila hücrelerin primer kültürlerinin gelişim model, büyük ölçüde muhtemelen birincil hücre hazırlık sürecinde çeşitli değişkenlere bağlı olarak değişebilir . Her şeyden önce, yumurtlama için kullanılan uçar genç (eski bir hafta içinde) ve sağlıklı (viral ya da bakteriyel enfeksiyon ücretsiz). Bunlar işe yaramaz ve bu embriyoların elde edilen hücrelerin ayırt edemez ve sadece 1-2 gün hayatta olarak gübresiz veya enfekte embriyolar kaçınılmalıdır. İkincisi, homojenizasyon işlemi sırasında, çok fazla embriyolar ile aşırı Homojenizatör önemlidir. Çok fazla embriyoların Homojenizatör Aşırı yükleme enkaz ve ölü hücreleri, hücre farklılaşması sonunda uzlaşma olacak sayısı miktarında artışa neden olacak. Son olarak, hücrelerin primer hücrelerde iyi farklılaşmayı sağlamak için uygun bir yoğunlukta kaplama olmalıdır. Biz birincil hücreler başlangıçta çok yüksek bir yoğunlukta numaralı seribaşı nöron ve kas hücreleri hem de farklılaşma önemli ölçüde azalır bulundu.
Fenotipik analizi için, 384-kuyucuğu genellikle daha düşük bir büyütme tarama veya görüntüleme analizi için birincil hücre büyümesi için kullanılır. Çok daha yüksek bir büyütme ve daha iyi çözünürlüğe sahip görüntüler konfokal mikroskop kullanarak görüntüleme, canlı ya da lekeli hücreleri ya bir kapak cam haznesi kaydırağı, büyüyen hücreleri tarafından elde edilebilir. En birincil hücreler yapışık olduğundan, oda slaytları iyi büyüyen hücrelerin, hücre sayısı ve her bir kuyu için gerekli ortamın miktarı tahmini için bir kılavuz olarak kullanılmalıdır. Buna ek olarak, kapak cam odası slaytlar, insan vitronectin gibi ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleri ile kaplı olabilir, laminin ve kollajen IV-faiz hücreleri farklılaşma izin vermek. Örneğin, birincil kaslar, ama iyi ECM-kaplı kapak cam kaplı olmayan kapak camına kötü ayırt. Son olarak, kültür ortamı, Kalkan ve Sang M3 gibi düzenli bir kültür ortamı, yayılan otofloresans azaltmak için sağ görüntüleme önce bir sinek gibi HL6 gibi fizyolojik salin tampon, değiştirilmesi gerekir.
Prensip olarak, bu protokol, canlı ve verimli homozigot mutant stokları gibi herhangi bir genotipleri, sinekler ve olan embriyolar, GFP, ifade dayalı bir sıralayıcı tarafından elle seçilmiş ya da bu birincil hücrelerinin hazırlanması için kullanılır, ya da ifade edilebilir doku-spesifik Gal4, UAS-gen X genotipler. Bu protokol, diğer deney yöntemleri ile birlikte, çeşitli sorular ele alınacak izin, özellikle bu nöronlar ve kaslar olarak farklılaşmış hücre ile ilgili olduğunu ve kültürlü hücre hatları ele alınması zor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
JB Damon Runyon Kanser Araştırma Vakfı Bursu DRG-1716-1702 tarafından desteklenmiştir. JZ NIH / NIGMS Bursu F32 GM082174-02 tarafından desteklenmiştir. NP Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nden bir araştırmacı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 US standard testing sieve | VWR international | 57334-454 | |
| #45 US standard testing sieve | VWR international | 57334-462 | |
| #120 US standard testing sieve | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, 384-well plate | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
