Summary
Vi erbjuder ett detaljerat protokoll för att förbereda galvaniska element skiljas från
Abstract
Här beskriver vi en metod för att förbereda och odling primärceller skiljas från Drosophila gastrula embryon. I korthet, iscensatte en stor mängd embryon från unga och friska flugor samlas, steriliseras och sedan fysiskt dissocierade till en enda cell suspensionen med hjälp av ett glas homogeniseringsapparat. Efter att ha pläterade på odlingsplattor eller diabilder kammare vid en lämplig täthet i ett odlingsmedium kan dessa celler differentiera vidare i flera morfologiskt-olika celltyper, som kan identifieras genom sina specifika cell markörer. Dessutom presenterar vi förutsättningar för att behandla dessa celler med dubbla strandsatta (DS) RNA att framkalla gen knockdown. Effektiv RNAi i Drosophila galvaniska element åstadkoms genom att helt enkelt bada cellerna i dsRNA innehållande odlingsmedium. Möjligheten att genomföra effektiva RNAi störning, tillsammans med andra molekylära, biokemiska, cell imaging analyser, kommer att möjliggöra en mängd olika frågor som skall besvaras i Drosophila galvaniska element, särskilt de som rör differentierade muskler och neuronala celler.
Protocol
1. Beredning av flyger burar
- Grow Drosophila (vildtyp stammar som Oregon-R-eller genotyp) i praktisk behållare som 32-oz insekt koppar.
- Överför nya eclosed flyger till stora embryo-samling burar eller flyga befolkningen burar.
- Flytta burar in i ett rum med en temperatur på ~ 25 ° C och luftfuktighet ~ 65% i en ljus 12-h och en mörk 12-h cykel för att underlätta insamlingen av synkrona embryon.
- Behåll flugorna i burarna genom att mata dem dödades jäst pasta strimmig om melass tallrikar. Ändra melass plattor (med döda jäst pasta) en gång dagligen under 2-3 D.
2. Insamling av synkron embryon
- På dagen av primär-cellberedningen, mata flugor WTH färska plattor belagda med dödade jäst pasta för en 1-2 timmar före låg period.
- Strax innan 12-tim mörker-cykel ersätta pre lägga plattorna med färska melass plattor strimmig med en minimal mängd av jäst pasta. Kasta före låg samlingen, som innehåller asynkron äldre embryon.
- Samla embryon för en period av 1-2 h.
- Ta bort plattorna med relativt synkrona befolkningen av embryon och förvara vid 25 ° C i 5-6 h. Embryon kommer att vara på avancerad gastrulastadium vid denna tid.
3. Insamling och tvättning av embryon
- Lossa embryon från plattorna med en våt pensel och skölj noga med ljummet kranvatten genom ett staplade Siktsatsen, så att embryona samlas i den finaste sikt med maskstorlek på botten. Skölj i några minuter för att ta bort så mycket jäst och flyga skräp som möjligt.
- Tippa såll så att embryona samlas på ena sidan, och försiktigt tvätta bort dem från sikten till en dechorionation korg.
- Flytta till vävnadsodling huven område utan låta embryona torka ut.
4. Homogenisering av embryon och plätering av celler
- Sterilisera och dechorionate embryona genom att sänka ner dem i 50% (vol / vol) blekmedel 5-10 min. Skölj embryon från väggen i korgen med 70% (vol / vol) etanol. Alternativt tvätta bleka bort embryon med destillerat vatten innan etanol behandling. Från denna punkt framåt embryon skall hanteras under sterila förhållanden och i vävnadsodling huven.
- Skölj embryon noggrant för att ta bort blekmedel och / eller etanol med autoklaveras destillerat vatten.
- Under dechorionation steget, fylla en Dounce homogeniseringsapparat med lämplig volym av rumstemperatur M3 medel baserat på mängden av embryon. Förhållandet mellan volymen av embryon och att media bör inte vara över 0,5 ml embryon: 40 ml-media (eller ~ 100-200 embryon / ml).
- Placera sköljda embryon i en steriliserad bägare med den mängd av M3 medier nog för att dränka den embryon. Låt embryon blöt i 2-5 min.
- Demontera dechorionation korgen och blot Nitex mesh torka med steriliserad hushållspapper.
- Överför embryon till homogeniseringsblandare med en steriliserad pensel.
- Homogenisera försiktigt med korta drag med hjälp av en lös stöt utan att nå botten av röret tills alla embryon är upphängda. Sedan försiktigt, men bestämt, homogenisera med åtta fulla slag. Vrid inte mortelstöt när den rör sig upp och ner.
- Överför homogenatet i en steril 50 ml koniskt centrifugrör antingen genom att hälla eller pipettering, och förslut röret.
- Centrifugera 10 min vid 40 g, rumstemperatur till pellets vävnaden skräp, stora cell klumpar och membran vitelline. Överför supernatanten som innehåller celler och äggulan till ett rent rör och upprepa centrifugering steg i 5 minuter.
- Försiktigt Överför supernatanten genom att hälla eller pipettering i ett rent rör och spinna i 10 min på 360g, rumstemperatur till pellets cellerna. Kassera supernatanten. Resuspendera cellpelleten i 10 ml odlingssubstrat (serumfritt medium för RNAi experiment).
- Räkna livsdugliga celler med hjälp av en hemocytometer att uppskatta celltätheten. Under tiden upprepa steg 4,10 till pellets cellerna.
- Resuspendera cellerna till önskad koncentration. För att starta, prova ett urval av 1 ~ 5 x10 6 celler / ml och platta ut vid 1,7 till 2,5 x10 5 celler / cm 2.
5. Primär-cell RNAi för celler odlas på en 384-brunnars platta
- Dispensera 5 ìl dsRNAs i varje brunn på en slutlig koncentration av ~ 250 ng per brunn i en 384-brunnar.
- Använd en flerkanals pipett dosera 10 ml (1 ~ 4x106 celler / ml) av primära celler per brunn i en serumfritt M3 medium i ett 384-brunnars platta som innehåller en annan dsRNA i varje brunn. Alternativt kan cellerna odlas på 8-brunnars objektglas glas kammare för konfokal avbildning.
- Centrifugera plattorna i 1 min på 300g, rumstemperatur. Kultur cellerna i serumfritt medium vid 25 ° C i 22 h eller vid 18 ° C i 1-2 D.
- Tillsätt 30 ml serum innehållande odlingsmedium i varje brunn. Centrifugera plattorna i 1 min på 300g, rumstemperatur.
- Lägg plattorna i en fuktig kammare och kultur den primära celler för ytterligare 5 ~ 7 d vid 25 ° C.
- Bild cellerna lever antingen eller efter immunofluorescens färgning.
6. Representativa resultat:
Under optimala förhållanden, kommer cellerna i kulturen ser friska med en rund morfologi. Kulturen kommer att ha liten cell skräp, och vara 50 ~ 80% konfluenta efter första plätering. Dessa celler kommer att genomgå morfologiska förändringar efter att ha varit odlade under en längre tid. Det brukar ta ungefär 5-8 dagar för celler i kulturen vara fullt differentierade vid 25 ° C. Bra kvalitet primära kulturer brukar bedömas efter hur väl de celler-av-intresse är differentierade i kultur. Till exempel, primär muskelceller har ofta en filial-liknande morfologi och bli flerkärniga myotubes med rand-liknande myofibrils som består av en serie sarkomerer. Fullt differentierade myotubes kommer oftast spontant röra sig i kulturen. Däremot differentierade primära nervceller bildar kluster med sin cell-kroppar, och få kontakt med andra kluster med sina Axon kablar.
Figur 1. Primärceller genomgå morfologiska förändringar efter att ha varit klädd i kulturen
(A) Ett ljust fält bild av galvaniska element direkt efter att beläggas med en brunn på en 384-brunnar. Majoriteten av cellerna är runda och intakta och väl åtskilda. (B) Ett ljust fält bild av primär cellkultur 20 timmar efter plätering. Primärceller utgör redan kluster (stora pilspets) och muskler med en gren-liknande morfologi (lång pil) kan kännas igen i detta skede. (C) En faskontrast bild av primär kultur 5 dagar efter plätering. Kulturen ser mycket mer avancerad, med neuronala förlängningar (små pilar), neuronala kluster (stora pilspetsar) och muskler (medelstora pil).
Figur 2. Exempel på primära celler som behandlats med dsRNAs odlas i ett 384-brunnars platta
Primärceller var isolerade från Embryon som Dmef2-Gal4, D42-Gal4, UAS-Mito-GFP transgener, där Dmef2-Gal4 och D42-Gal4 köra uttryck av Mito-GFP i muskler och nervceller motor, respektive. Cellerna behandlades med dsRNAs inriktning på endera lacZ (AC) eller uppblåst (om) (DF). Både primära muskler och nervceller kan ses av GFP (A, C, D, F). De vita pilarna pekar på neuronala anknytningar. Phalloidin färgning av aktin (pilspetsar) avslöjar en gren-liknande muskel struktur i den kultur som behandlas med lacZ dsRNAs (B och C), men round-up muskel morfologi i kulturen behandlas med om dsRNAs (E och F). I det sammanslagna bilderna (C, F), är muskler färgas gult, men rött negativa visar nervceller och deras förlängningar (vita pilar).
Figur 3. Konfokala micrographs primära muskler odlade på mänskliga vitronektin-belagda objektglas skyddsglas
Primära muskler var immunofluorescently färgade med anti-Drosophila Titin (KZ) (röd i kopplingen) och phalloidin för aktin (gröna i kopplingen). Den översta panelerna är vildtyp kontroll muskel och botten som är de SALS (CG31374) RNAi muskeln med förkortade sarkomerer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvecklingsarbetet mönster av primära kulturer av Drosophila celler kan variera mycket, möjligen på grund av flera variabler under den primära celler beredningsprocessen. Först av allt, flugor som används för äggläggning bör vara unga (inom en vecka gammal) och friska (fria från virus-eller bakterieinfektion). Obefruktade eller infekterade embryon måste undvikas, eftersom de är värdelösa och celler från dessa embryon inte kan skilja och kommer bara överleva 1-2 dagar. För det andra, under homogenisering processen är det viktigt att inte överbelasta homogeniseringsblandare med alltför många embryon. Överbelastning av homogeniseringsblandare med alltför många embryon kommer att orsaka en ökning av mängden av skräp och antalet döda celler, som så småningom kommer att kompromissa celldifferentiering. Slutligen bör cellerna beläggas med en lämplig täthet att säkerställa en god differentiering av galvaniska element. Vi fann att differentiering av både nervceller och muskelceller drastiskt reduceras när primära celler seedade initialt till en alltför hög densitet.
För fenotypisk analys, är 384-brunnars plattor vanligtvis används för att odla galvaniska element för screening eller bildanalys på en lägre förstoring. Bilder med en mycket högre förstoring och bättre upplösning kan uppnås genom växande celler på en cover-glas kammare bild, följt av imaging antingen live eller färgade celler med hjälp av en konfokalmikroskop. Eftersom de flesta primära celler är anhängare ska området för växande celler i brunnen avdelningsordförande bilder kan användas som en riktlinje för uppskattning av både antalet celler och mängden av medium som krävs för varje brunn. Dessutom kan täcka glas kammare diabilder vara belagd med extracellulära matrix (ECM) proteiner såsom mänskliga vitronektin till laminin eller kollagen IV tillåter differentiering av celler-av-intresse. Till exempel primära muskler som skiljer dåligt på den icke-belagda cover-glas, men väl på ECM-belagda cover-glas. Slutligen bör för att minska autofluorescens avges från odlingsmedium, den vanliga odlingsmedium som Shield och sjöng M3, ersättas med en fluga fysiologisk buffert, såsom HL6, precis innan avbildning.
I princip kan detta protokoll används för beredning av primära celler från flugor med alla genotyper, t.ex. från homozygota livskraftiga och fertila mutant lager, och från dem vars embryon kan väljas manuellt eller med en sorterare baserat på uttryck av GFP, eller uttrycka vävnadsspecifika Gal4, UAS-genen X genotyper. I kombination med andra experiment metoder kommer protokollet tillåta en mängd olika frågor att tas upp, särskilt de som är relaterade till differentierade celler som nervceller och muskler, och är svåra att tas upp i odlade cellinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
JB fick stöd av Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship DRG-1716-02. JZ fick stöd av NIH / NIGMS Fellowship F32 GM082174-02. NP är en utredare från Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 US standard testing sieve | VWR international | 57334-454 | |
| #45 US standard testing sieve | VWR international | 57334-462 | |
| #120 US standard testing sieve | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, 384-well plate | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
