Summary
نقدم الإجراء الذي يمكن أن تستخدم ثنائي الأبعاد agarose هلام تحليل لتحديد هيكل وسيطة النسخ التالية التي تحدث للاشعة فوق البنفسجية.
Abstract
النسخ غير دقيقة في وجود الحمض النووي من التلف هي المسؤولة عن غالبية إعادة ترتيب الخلوية والطفرات التي لوحظت في جميع أنواع الخلايا ، ويعتقد على نطاق واسع لتكون مرتبطة مباشرة مع تطور السرطان لدى البشر. الحمض النووي من التلف ، مثل تلك التي تسببها أشعة فوق البنفسجية ، ويضعف بشدة قدرة تكرار لتكرار قالب الجينومية بدقة. وقد تم تحديد عدد من المنتجات التي يتم الجينات المطلوبة عند تكرار اللقاءات آفات الحمض النووي في القالب. ومع ذلك ، فقد كان التحدي المتبقية لتحديد كيفية معالجة هذه الآفات البروتينات أثناء النسخ المتماثل
Protocol
1. النمو والإشعاع فوق البنفسجي.
- 200μl ثقافة جديدة بين عشية وضحاها التي تحتوي على البلازميد pBR322 نمت في المتوسط ديفيس 1 تستكمل مع السكر بنسبة 0.4 ٪ ، 0.2 ٪ الأحماض casamino ، و 10 ميكروغرام / مل الثايمين (DGCthy متوسطة) و 100 ميكروغرام / مل الأمبيسيلين هو المحبب. هو معلق ثم بيليه خلية في المتوسط DGCthy 200μl تفتقر أمبيسلين واستخدامها لتلقيح 20 مل من DGCthy المتوسطة.
- تزرع الثقافات دون انتقاء الأمبيسيلين في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية إلى 600 من OD 0.5 (~ 5 × 10 8 خلايا / مل). النمو دون الأمبيسيلين يتجنب اختيار سيطة ضد النسخ غير طبيعية أو غير المنتجة التي قد تنشأ في بعض المسوخ. بالإضافة إلى ذلك ، إذا باستخدام الأشعة فوق البنفسجية للحث على الضرر ، وإزالة الأمبيسيلين من وسائل الإعلام أمر ضروري لأنها تمتص موجات بقوة في هذه الخلايا والدروع ، وخفض الجرعة الفعالة للأشعة فوق البنفسجية.
- يعملون تحت الاضواء الصفراء ، يتم وضع الثقافة في صحن قطره 15cm بيتري على منصة الرئاسة الدورية للتحريض. توضع ثقافاتنا على مسافة من مصباح 15 واط مبيد للجراثيم التي تنتج نسبة التعرض للJ/m2/sec 1 ~ ، والتي تقاس باستخدام مضواء UVC. والمشع الثقافات مع 50 J/m2 ثم وضعت على الفور العودة الى اهتزاز الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة التجربة. وتنتج هذه الجرعة ، في المتوسط ، 1 cyclobutane بيريميدين ديمر كل من 4.5 كيلوبايت ssDNA. الإضاءة الصفراء استنشاط ضوئي يمنع انعكاس للdimers بيريميدين cyclobutane بواسطة photolyase.
2. الحمض النووي العزل.
- في بعض الأحيان عندما سيطة النسخ المتماثل للفحص ، يتم وضع قسامة 0.75 مل من ثقافة الى 0.75 مل NET30 الاحتياطي الجليد الباردة (100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 30 ملم EDTA) ووضعها على الجليد حتى نهاية الوقت بطبيعة الحال. نحن عادة تشغيل دورة الوقت 90 دقيقة ، مع فحص العينات في 0 ، 15 ، 30 ، 45 ، 60 ، و 90 دقيقة. وEDTA ودرجة الحرارة الباردة تخدم على نحو فعال لوقف تكرار والنوكليوتيدات إصلاح الختان.
- كل عينة ومن ثم مكعبات ، معلق في 150 ميكرولتر من الليزوزيم ملغ / مل 1.5 و 0.2 ملغ / مل RNaseA في TE (10 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 1 ملم EDTA) ، وlysed عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. في هذا الوقت ، تضاف 10μl K من بروتين (10mg/ml) و10μl sarkosyl من 20 ٪ ويسمح للحضانة أن يستمر لمدة 1 ساعة. بروتين كاف وsarkosyl مساعدة للافراج عن شظايا من الحمض النووي التي قد تترافق مع غشاء أو البروتينات قبل استخراج الفينول يحدث. منذ غالبا ما يرتبط بنشاط لتكرار الحمض النووي مجمعات البروتين أو الغشاء ، وهذا يساعد على زيادة العائد من شظايا النسخ المتماثل التي يتم استردادها.
- ثم يتم استخراج عينات عن طريق إضافة وحدات التخزين 2 من الفينول لكل عينة والمقلوب بلطف الأنابيب لمدة 5 دقائق. ثم يتم إضافة كميات من كلوروفورم 2 / كحول أيزو أميلي (24 / 1) ومعكوس بلطف الأنابيب مرة أخرى لمدة 5 دقائق.
- وطرد العينات في 14000 دورة في الدقيقة في microcentrifuge لمدة 5 دقائق ، والمرحلة مائي أعلى من كل عينة يتم إزالتها ، ووضعها في أنبوب جديد. ثم تضاف 4 مجلدات من كلوروفورم / كحول أيزو أميلي (24 / 1) ، والمقلوب بلطف الأنابيب لمدة 5 دقائق ، وطرد مرة أخرى في الدقيقة 14000 لمدة 5 دقائق.
- ومن ثم مدال الأعلى ، المرحلة المائية في كل عينة لمدة 1 ساعة من خلال الكشف عن 100μl من كل عينة على قرص Whatman 47mm 0.025 ميكرون المسام التي تعوم على 250 مل من TE 0.1X في كوب. لأن هياكل تكرار مع المناطق حبلا واحد أو نقطة فرع هم أكثر عرضة للتقطيع ، ونحن عادة قطع نصائح ماصة لدينا قبالة بشفرة حلاقة لجعل الفم على نطاق أوسع وتقليص القوات القص. بصفة عامة ، ينبغي أن يوضع pipetting إلى أدنى حد ممكن حتى بعد أن تم هضم الحمض النووي مع إنزيمات التقييد.
- ثم هضم كل عينة مع PvuII (نيو إنجلاند Biolabs) الذي linearizes على البلازميد المصب فقط من أصل النسخ المتماثل.
- قبل التحميل في agarose هلام ، وكلوروفورم 100μl 20μl صبغة تحميل 6X الذي يحتوي Bromophenol زرقة السيانول الزيلين وتضاف إلى كل عينة والمختلط. ثم ، يتم تحميل 40μl المرحلة مائي يحتوي على صبغة التحميل في هلام. لتقليل الفوارق الهيكلية ، التحف الهيكلي ، وتقطيع الحمض النووي ، وهذا الإجراء عزلة لا يتضمن أي خطوات لإثراء للمناطق حبلا واحدة ، يعجل ، أو التركيز على عينات من الحمض النووي بعد انحلال الخلايا.
3. 2D جل وتحليل الجنوبية.
- تم تعديل 2 الأبعاد agarose هلام التحليل في الفترة من 3. البعد عن 1ST ، يتم تشغيل من خلال عينات من الحمض النووي يقتصر جل agarose 0.4 ٪ في 1X TBE في 1V/cm. لتر واحد من 10X TBE محلول المخزون يحتوي على :
- 108 غ من قاعدة تريس
- حمض البوريك 55 ز
- 40 مل EDTA 0.5M (الرقم الهيدروجيني 8.0)
- تم تحميل حجم امدا الثالث هند علامة في حارة أولا ، ثم يتم تحميل العينات في كل حارة أخرى. نحن عادة تشغيل د first~ imension 12-15 ساعة. تخطي الحارات يجعل من الاسهل لشريحة من الممرات ليلقي في البعد الثاني. الجهد المنخفض والمنخفض في المئة agarose هلام يعمل على فصل الحمض النووي شظايا يستند أساسا على الحجم.
- عن البعد الثاني ، وشرائح ممرات للخروج من هلام هلام البعد الأول باستخدام سكين جزار كبيرة ل. يمكن أن تكون ملطخة الممر الأول الذي يحتوي على علامة امدا الثالث هند مع بروميد إيثيديوم. باستخدام علامة امدا الثالث هند كمحصول ، دليل وتجاهل منطقة جل أن أدناه حيث من المتوقع أن البلازميد خطي لتشغيل. في ظل هذه الظروف ، نجد أن تدير خطي pBR322 أعلى قليلا من cyanol الزيلين وصمة عار.
- للإدلاء البعد الثاني ، هو وضع كل حارة أفقيا في أعلى عجلة من هلام فارغة. ويتم إعداد حل agarose 1.0 ٪ في TBE 1X وتبريده الى 55 درجة مئوية. في هذا الوقت ، يتم صب جل في حل للادلاء البعد الثاني ، والتأكد تماما لتغطية شرائح هلام. بمجرد أن وضعت جل ، يتم تشغيله في 6.5V/cm في وحدة الكهربائي الذي يسمح للالعازلة إعادة توزيع. نحن عادة تشغيل البعد الثاني ~ 5،5-7 ساعة. الجهد العالي وارتفاع في المئة agarose هلام يفصل فعليا شظايا الحمض النووي استنادا إلى شكلها ، فضلا عن حجمها. الأشكال الخطية تشغيل أكثر ببطء من خلال البعد الثاني.
- رحلان التالية ، ثم تشطف وتغسل الجل في H 2 O ، مرتين في 400ml 0.25M من حمض الهيدروكلوريك لمدة 15 دقيقة ، شطف مع H 2 O ، وغسلها بعد ذلك مرتين في 400 مل من هيدروكسيد الصوديوم 0.4M لمدة 30 دقيقة. حامض يغسل تعمل على النك جزئيا جزيئات الحمض النووي إلى أجزاء أصغر أن نقل أكثر كفاءة. هذه الخطوة ضرورية نظرا لكبر حجم وأشكال غير عادية من وسيطة تكرار الحمض النووي.
- ثم يتم نقل الحامض النووي في المواد الهلامية إلى N + Hybond غشاء النايلون 4. نستخدم نظام الهبوط مع هيدروكسيد الصوديوم القلوية نقل 0.4M. باختصار ، وضعت ورقتين من الورق النشاف غارقة في 0.4M هيدروكسيد الصوديوم في كومة كبيرة من مناشف ورقية. هي أيضا غارقة في غشاء النايلون في 0.4M هيدروكسيد الصوديوم ، ووضعها على رأس الورق النشاف. ثم هو جل الطبقات بعناية على رأس هذا ، يليه آخر قطعة من الورق النشاف ، المبللة في محلول هيدروكسيد الصوديوم. وأخيرا ، الطبقات قطعة طويلة من الورق النشاف المبللة في أعلاها وتوضع لها طرفي في الأطباق التي تحتوي على 1 لتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم 0.4M لتكون بمثابة الفتيل. نسمح عادة لنقل الحمض النووي ل12/06 ساعة.
- تغسل تتم إزالة غشاء النايلون ، 20-30 ثانية في مخزن SSC 5X ، ووضعها في زجاجة التهجين الأسطوانة التي تحتوي على محلول 10.5ml Prehybridization. إذن ، هو الغشاء حضنت في درجة حرارة 42 درجة مئوية مع تناوب أكثر من 6hrs. Prehybridization الحل :
- 5.0 مل formamide
- 0.5 مل SDS 20 ٪
- 2.5 مل * SSC 20X
- 2.0 مل 50X دينهارت و*
- 0.5 مل الحيوانات المنوية سالمون الحمض النووي (10mg/ml)
* يمكن الاطلاع على وصفات لمحكمة أمن الدولة في ودينهارت في 5
- خلال الفترة prehybridization ، هو المسمى 1 ميكروغرام من pBR322 البلازميد مع 32P النك عن طريق الترجمة وفقا للبروتوكول التي قدمتها ألفا به روش المسمى [32 ف] - dCTP. التحقيق radiolabeled (100μl) هو التشويه والتحريف التي يحتضنها عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في الانبوب microcentrifuge المسمار كأب ، ثم وضعت على الفور على الجليد.
- واضاف ان التحقيق متمسخ إلى 5.9 مل حل التهجين ، والتي تتضمن ما يلي :
- 3.0 مل formamide
- 1.5 مل SSC
- 1.0 مل H 2 O
- 0.15 مل 50X ودينهارت
- 0.10 مل SDS 20 ٪
- 0.15 مل سالمون 10mg/ml الحمض النووي الحيوانات المنوية
- يسكب prehybridization الحل للخروج من القمقم الأسطوانة وسكب محلول التهجين فيها ثم يتم إرجاع زجاجة الأسطوانة إلى الحاضنة 42 درجة مئوية وتناوب لأكثر من 12hrs.
- يسكب التهجين الحل للخروج من القمقم الدوارة. إذن ، هو غسل لطخة 4 مرات لمدة 20 دقيقة في زجاجة 150 مل مع الأسطوانة ~ حل غسل تحتوي SSC 0.5X ، SDS 0.1 ٪ في 42 درجة مئوية مع التناوب.
- بعد غسل الماضي ، تم وضع غشاء على منشفة ورقية حتى السائل قد اختفت بشكل ملحوظ. ثم يتم تغليف الغشاء في غلاف بلاستيكي البولي فينيل كلوريد ، ومعرضة للشاشة phosphorimager. علينا تصور وقياس النشاط الإشعاعي باستخدام العاصفة 840 وبرمجياتها ImageQuant المرتبطة بها.
4. ممثل النتائج :
الشكل 1. وسيطة النسخ البلازميد التي لوحظت في وجود وعدم وجود الحمض النووي من التلف الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية ، ونمط الهجرة من PvuII هضمها pBR322 البلازميد التي لاحظها - 2D agarose هلام التحليل هو تخطيطي. غير تكرار البلازميدات الخطية وتشغيل جزء 4.4 كيلوبايت الخطية. البلازميدات تكرار النموذج على شكل Y الهياكل التي تهاجر أبطأ من شظايا غير تكرار نظرا لحجم أكبر وليسnlinear الشكل. هذا النمط الهجرة تشكل قوس يمتد من خارج المنطقة الخطي نحو البئر. ويلاحظ التالي للأشعة فوق البنفسجية تشعيع ، انقر نقرا مزدوجا Y X أو جزيئات على شكل مخروط في المنطقة التي يهاجر ببطء أكثر من قوس على شكل Y الجزيئات. ويرد مثال للتحليل الجنوبي من هلام 2D بحث مع 32P المسمى pBR322 للخلايا مباشرة بعد اشعة فوق البنفسجية وبعد 15 دقيقة من أشعة فوق البنفسجية (مستنسخة بإذن من الناشر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها من خلايا نموذجية النوع البري في حضور وغياب الأشعة فوق البنفسجية التي يسببها تلف في الشكل 1. في غياب أي ضرر ، ويمكن العثور ~ 1 ٪ من الحمض النووي للبلازميد الإجمالي في قوس Y عندما الخلايا تنمو بسرعة في مرحلة الأسي. بعد التشعيع ، لوحظ زيادة عابرة في شكل جزيئات Y كما منعت تكرار الشوك تتراكم في المواقع المتضررة. وسيطة النسخ X - شكل عابر أيضا تتراكم وتستمر حتى الوقت الذي يرتبط عندما يتم إصلاح الآفات.
بدلا من تحليل الجنوبية ، يمكن لكمات على وسيطة النسخ المتماثل للخروج من هلام مع قش الشرب البلاستيكية وتنقيته ، والإشراف المباشر من قبل المجهر الإلكتروني. وقد استخدمنا هذا النهج بنجاح لتحديد المنتجات الجينات المطلوبة لعملية النسخ المتماثل الشوك التي تواجه التلف في الحمض النووي وتحديد وسيطة النسخ الشاذة التي تتراكم في هذه المسوخ. بالإضافة ، يمكن تعديلها بسهولة هذا النهج لدراسة أشكال أخرى من الحمض النووي من التلف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم العمل في المختبر لدينا من قبل جائزة التوظيف MCB0551798 من المؤسسة الوطنية للعلوم ومنطقة منحة R15GM86839 من NIGMS - NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE Healthcare | G15T8 | Yellow Lighting |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer |
| 0.025 μm pore disks | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | Floating dialysis disks |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease |
| Nick-translation kit | Roche Group | 976776 | To make 32P-labeled probe |
| Blotting Paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | For Southern transfer |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli. Science. 299, 1064-1067 (2003).
- Friedman, K. L., Brewer, B. J. Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).
- Spivak, G., Hanawalt, P. C. Determination of damage and repair in specific DNA sequences. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A laboratory manual. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli. J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli. Genetics. 166, 1631-1640 (2004).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli. J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).
- Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest. J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli. Radiat Res. 168, 499-506 (2007).
- Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions. Mutat Res. 645, 19-26 (2008).
