Summary
Мы представляем процедура, посредством которой двумерной агарозном гель-анализ может быть использован для определения структуры репликации промежуточных, которые происходят следующие УФ-облучения.
Abstract
Неточный репликации в присутствии ДНК является причиной большинства сотовых перестановок и мутагенеза наблюдается во всех типах клеток, и многие считают, непосредственно связанные с развитием рака у людей. Повреждение ДНК, как, например, индуцированной УФ-излучением, сильно снижает способность репликации дублировать геномной шаблон точно. Ряд продуктов генов были идентифицированы, которые необходимы при репликации встреч повреждений ДНК в шаблоне. Тем не менее, остающиеся проблемы в том, чтобы определить, как эти повреждения белков процесс во время репликации
Protocol
1. Рост и УФ-облучения.
- 200 мкл свежей ночной культуры содержащие плазмиды pBR322 выросли в Дэвисе среду 1 дополнена с 0,4% глюкозы, 0,2% casamino кислоты и 10 мкг / мл тимин (DGCthy среды) и 100 мкг / мл ампициллина является гранулированный. Осадок клеток, затем ресуспендировали в 200 мкл среды DGCthy хватает ампициллин и используют для инокуляции 20 мл DGCthy среды.
- Культуры, выращенные без ампициллин отбора в пожимая инкубаторе при температуре 37 ° С до OD 600 из 0,5 (~ 5 × 10 8 кл / мл). Рост без ампициллин избегает отбора против ненормального или непродуктивные репликации промежуточные, которые могут возникнуть в некоторых мутантов. Кроме того, при использовании УФ-света, чтобы вызвать повреждение, удаление ампициллин из средств массовой информации необходимо потому, что она сильно поглощает на этих длинах волн и щиты клеток, снижение эффективной дозы УФ.
- Работая под желтыми огнями, культура находится в 15 см диаметром блюдо Петри на вращающейся платформе для агитации. Наши культуры размещены на расстоянии от 15-ваттной бактерицидной лампой, которая производит экспозиционной дозы ~ 1 J/m2/sec, которая измеряется с помощью UVC фотометра. Культуры облучении с 50 Дж/м2, а затем помещается сразу же обратно в встряхивания 37 ° C инкубаторе в течение всего срока эксперимента. Эта доза производит, в среднем, 1 циклобутанового пиримидиновых димеров каждые 4,5 кб оцДНК. Желтый освещение предотвращает фотореактивации-поворотом димеры пиримидинов циклобутанового по photolyase.
2. Выделения ДНК.
- В периоды, когда репликации промежуточных должны быть рассмотрены, 0,75 мл аликвоту культуру помещают в 0,75 мл ледяной NET30 буфера (100 мМ NaCl, 10 мМ Трис, рН 8,0, 30 мМ ЭДТА) и помещают на лед до конца время курса. Мы обычно работают 90 минут времени, конечно, с образцами рассмотрены на 0, 15, 30, 45, 60 и 90 минут. ЭДТА и холодные температуры служить эффективно остановить репликации и репарации нуклеотидов иссечения.
- Каждый образец затем гранулированный, ресуспендировали в 150 мкл 1,5 мг / мл лизоцима и 0,2 мг / мл RNaseA в TE (10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) и лизировали при температуре 37 ° С в течение 20 мин. В это время, 10 мкл протеиназы К (10mg/ml) и 10 мкл 20% sarkosyl добавляются и инкубации будет продолжаться в течение 1 часа. Протеиназы К и sarkosyl помочь в освобождении фрагментов ДНК, которые могут быть связаны с мембраной или белки до фенольной экстракции происходит. Так как репликация ДНК активно часто связан с белком или мембранных комплексов, это помогает увеличить выход репликации фрагменты, которые выздоровели.
- Образцы затем извлекается путем добавления 2-х томах фенола к каждому образцу и трубы аккуратно перевернутой течение 5 минут. Затем 2-х томах хлороформ / изоамиловый спирт (24 / 1) добавляются и трубы аккуратно перевернутой снова в течение 5 минут.
- Образцы центрифугировали при 14 000 оборотов в минуту в микроцентрифужных течение 5 минут и верхнюю водную фазу каждого образца удаляется, и помещены в новую пробирку. Затем 4 тома хлороформ / изоамиловый спирт (24 / 1) добавляются, трубы аккуратно перевернутой в течение 5 минут, и снова центрифугировали при 14000 оборотов в минуту в течение 5 минут.
- Сверху, водной фазы в каждом образце затем диализовали в течение 1 часа путем выявления 100 мкл каждого образца на 47 мм Whatman 0,025 мкм поры диск, который плавает на 250 мл 0.1X TE в стакан. Поскольку репликация структур с одной регионах прядь или точек ветвления, более восприимчивы к стрижка, мы обычно сократить наши советы пипетки с бритвой, чтобы сделать рот шире и минимизировать силы сдвига. В общем, пипетки должны быть сведены к минимуму только после ДНК был переваривается ферментами рестрикции.
- Каждый образец затем переваривают PvuII (Новая Англия Биолабс), который линеаризует плазмиды только вниз по течению от начала репликации.
- Перед загрузкой в агарозном геле, 100 мкл хлороформа и 20 мкл красителя 6X загрузки, который содержит бромфенолового синего и ксилола Cyanol добавляются к каждому образцу и смешанные. Затем, 40μl водной фазы, содержащей краситель загрузки загружается в гель. Чтобы свести к минимуму структурных перекосов, структурных артефакты, и ДНК стрижка, эта изоляция процедура не включает какие-либо шаги для обогащения для отдельных регионов пряди, осадка или концентрата образцы ДНК следующие лизиса клеток.
3. 2D гель и Южно анализа.
- 2-мерных агарозном гель-анализа изменяется от 3. За 1-е измерение, ограничено образцов ДНК пропускаются через 0,4% агарозном геле в 1X TBE на 1V/cm. Один литр маточного раствора 10X TBE содержит:
- 108 г Трис базы
- 55 г борной кислоты
- 40 мл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0)
- Лямбда-Hind III размер маркера загружается в первый переулок, то образцы будут загружены в любой другой полосе. Мы обычно работают первых гimension ~ 12-15 часов. Пропуск полос облегчает срез полосы из бросить во втором измерении. Низкое напряжение и низкий процент агарозном геле служит для разделения фрагментов ДНК в первую очередь основана на размер.
- Для второго измерения, гель полосы нарезанные из первых гель измерения с использованием ножа большого мясника. Первый переулок содержащие лямбда-Hind III маркера могут быть окрашены бромидом этидия. Использование лямбда-маркер Hind III в качестве ориентира, обрезать и выбросить область гель, который ниже, где линеаризованной плазмиды, как ожидается, для запуска. В этих условиях мы находим, что pBR322 линеаризованной проходит чуть выше ксилол cyanol пятно.
- Чтобы привести второе измерение, каждый переулок расположен горизонтально в верхней части пустой заклинателя геля. Раствор 1,0% агарозном в 1X TBE готовится и охлаждается до 55 ° C. В это время, гель раствор выливают в бросить второе измерение, убедившись, что полностью покрывают гелем ломтиками. Как только гель установил, она работает на 6.5V/cm в электрофореза единица, которая позволяет буфер для рециркуляции. Мы обычно работают второе измерение ~ 5,5-7 часа. Высокое напряжение и высокий процент агарозном геле эффективно отделяет фрагменты ДНК, в зависимости от их формы, а также размер. Нелинейные формы работать более медленно через второе измерение.
- После электрофореза гель, затем промыть в H 2 O, дважды промывают 400 мл 0,25 М соляной кислоты в течение 15 минут, промывают H 2 O;, а затем дважды промывают в 400 мл 0,4 М NaOH в течение 30 минут. Кислоты моет служить частично ник молекулы ДНК на более мелкие фрагменты, которые передают более эффективно. Этот шаг необходим в связи с большим размером и необычной формы промежуточных репликации ДНК.
- ДНК в гелях затем переведен в Hybond N + нейлоновую мембрану 4. Мы используем вниз щелочных системы передачи с 0,4 М NaOH. Короче говоря, двумя листами промокательной бумагой пропитанной 0,4 М NaOH размещаются на большую пачку бумажных полотенцах. Нейлоновую мембрану также пропитанную 0,4 М NaOH и поместили на вершине промокательной бумаги. Гель затем осторожно слой поверх этого, следует еще один кусок промокательной бумаги, смоченной в растворе NaOH. Наконец, длинный кусок промокательной бумаги смачивают является слоистым в верхней и двух его концах помещены в блюда, содержащие 1 л 0,4 М NaOH решение в качестве фитиля. Как правило, мы давайте переноса ДНК для часов 6-12.
- Нейлоновую мембрану удаляют, промывают 20-30 сек в 5 раз буфером SSC, и помещены в бутылки гибридизации ролик содержащие 10.5ml Решение Prehybridization. Затем мембрану инкубировали при 42 ° С при вращении более 6 часов. Prehybridization решение:
- 5,0 мл формамида
- 0,5 мл 20% SDS
- 2,5 мл 20х SSC *
- 2,0 мл 50X Денхардта *
- 0,5 мл ДНК спермы лосося (10mg/ml)
* Рецепты для SSC и Денхардта можно найти в 5
- Во время prehybridization период с 1 мкг плазмиды pBR322 помечена 32P по переводу ник в соответствии с протоколом поставляемые Roche с использованием альфа-меченых [32-P]-дЦТФ. Радиоактивным зондом (100 мкл) является денатурированным путем инкубации при 98 ° С в течение 10 минут в трубке микроцентрифужных винтовой крышкой, а затем поместить сразу на лед.
- Денатурированный зонд добавляется к 5,9 мл гибридизации решение, которое содержит:
- 3,0 мл формамида
- 1,5 мл SSC
- 1,0 мл H 2 O
- 0,15 мл 50X Денхардта
- 0,10 мл 20% SDS
- 0,15 мл 10mg/ml ДНК спермы лосося
- Prehybridization раствор выливают из ролика бутылку и гибридизации раствор выливают дюйма ролик бутылку, затем возвращается к 42 ° C инкубатора и вращается более 12 часов.
- Гибридизации раствор выливают из ролика бутылку. Затем пятно промывают 4 раза в течение 20 минут в роликах бутылку с ~ 150 мл мыть раствором, содержащим 0,5 Х SSC, 0,1% SDS при 42 ° С с вращением.
- После последней промывки мембраны находится на бумажное полотенце, пока жидкость не заметно исчезли. Мембрана то завернутое в поливинил-хлорида полиэтиленовой пленкой и подвергаются экране phosphorimager. Мы визуализировать и количественно радиоактивности использованием Буря 840 и связанных с ней ImageQuant программного обеспечения.
4. Представитель Результаты:
Рисунок 1. Плазмиды промежуточных репликации наблюдается в присутствии и в отсутствие УФ-индуцированного повреждения ДНК. Миграция структура PvuII переваривается pBR322 плазмиды наблюдали 2D-агарозном гель-анализа на диаграммах. Номера для репликации линейной плазмиды работать как линейный 4,4-кб фрагмент. Репликация плазмид форме У-образной формы структуры, которые мигрируют медленнее, чем без тиражирования фрагментов из-за их больших размеров и неnlinear форму. Эта миграция шаблон формы дуги, которая простирается от линейной области по отношению к хорошо. После УФ-облучения, двойное-Y или Х-образные молекулы наблюдаются в конус регионе, который мигрирует медленнее, чем дуга Y-формы молекул. Пример Южной анализ 2D гель исследовали с 32P-меченым pBR322 показано для клеток сразу после УФ-облучения и через 15 минут после УФ-облучения (воспроизводится с разрешения издателя).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Типичные результаты, полученные от дикого типа клетки в присутствии и в отсутствие УФ-индуцированного повреждения показаны на рисунке 1. При отсутствии повреждений, ~ 1% от общей плазмидной ДНК можно найти в дуге Y, когда клетки быстро растут в экспоненциальной фазе. После облучения, преходящее повышение Y формы молекул наблюдается как заблокированные вилки репликации накапливаются на поврежденные участки. Х-образный промежуточных репликации также временно накапливаться и сохраняться до времени, что коррелирует с при поражениях ремонтируются.
На месте Южного анализа, репликации промежуточных пригодные для штамповки из геля с пластиковой соломы питья, очищенный и непосредственно наблюдать с помощью электронной микроскопии. Мы использовали этот подход успешно идентифицировать генные продукты, необходимые для процесса репликации вилки, которые сталкиваются с повреждением ДНК и определить ненормальное промежуточных репликации, которые накапливаются в этих мутантов. Кроме того, этот подход может быть легко модифицирована для изучения других форм повреждения ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа в нашей лаборатории проводится при поддержке КАРЬЕРА награду MCB0551798 от Национального научного фонда и грант ОБЛАСТЬ R15GM86839 от NIGMS-NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE Healthcare | G15T8 | Yellow Lighting |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer |
| 0.025 μm pore disks | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | Floating dialysis disks |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease |
| Nick-translation kit | Roche Group | 976776 | To make 32P-labeled probe |
| Blotting Paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | For Southern transfer |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli. Science. 299, 1064-1067 (2003).
- Friedman, K. L., Brewer, B. J. Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).
- Spivak, G., Hanawalt, P. C. Determination of damage and repair in specific DNA sequences. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A laboratory manual. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli. J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli. Genetics. 166, 1631-1640 (2004).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli. J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).
- Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest. J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli. Radiat Res. 168, 499-506 (2007).
- Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions. Mutat Res. 645, 19-26 (2008).
