Summary
특발성 질환에 적응 면역의 미생물 목표 식별은 효소 연결된 immunospot 분석을 사용하여 수행할 수 있습니다.
Abstract
적응성 면역은 세포 내 병원균의 통관하는 중요한 구성 요소입니다. 인간이 반응을 감지하고 계량하는 능력은 중요한 진단 도구입니다. 효소 링크된 immunospot 분석 (ELISPOT)는 등 HIV 감염, 이식있는 사람으로 immunosuppressed 인구 및 스테로이드 사용을 포함한 미생물의 항원, 세포 면역에 대한 답변을 식별하는 능력에 대한 인기를 얻고있다. 이 분석은 면역 특정 미생물 항원에 대한 반응뿐만 아니라, 이러한 반응은 성격 Th1 또는 Th2 경우에는 구별을 계량하는 능력이 있습니다. ELISPOT은 염증의 사이트에 국한되지 않습니다. 그것은 주변 혈액뿐만 아니라 bronchoalveolar 세척, 대뇌 척수, 그리고 복수와 같은 적극적인 참여의 사이트 내에서 면역 반응에 대한 평가 능력에 다재 다능한 것입니다. 단일 또는 여러 항원에 대한 면역 반응의 검색이 가능합니다뿐만 아니라, 미생물 단백질 내의 특정 epitopes. 이 분석은 시간이 지남에 따라 면역 반응의 검출뿐만 아니라 호스트 T 세포에 의해 인식 항원의 구분을 용이하게합니다. 듀얼 컬러 ELISPOT assays의 두 크린 시토킨의 동시 표현의 검색이 가능합니다. 이 기술에 대한 최근의 애플 리케이션 extrapulmonary 결핵의 진단뿐만 아니라 면역 질환 감염성 항원의 공헌에 대한 조사를 포함합니다.
Protocol
다음과 같은 프로토콜을 위해, 우리는 관심의 세포로 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)를 사용합니다. 그러나,이 프로토콜은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다. 무균 기술을 사용하여 조직 문화 후드에서 분석을 수행합니다.
1 일 : 플레이트와 셀의 준비
- ELISPOT 플레이트를 타고 후드에서 엽니다.
- 가능한 경우, 별도로 하나의 잘 pipetting가 수용되어 다채널 pipettor를 사용 1X PBS 150 μL와 접시에게 3 번 씻으십시오.
- 저수지의 패키지를 꺼내서 후드에서 엽니다.
- 2 μg / ML 캡처 항체의 안티 - 인간 인터페론 - γ, 11 1X PBS의 MLS. 추가 잘 와동. 저수지에 항체 믹스를 전송합니다.
- 각 잘 다중 채널을 사용에 코팅 용액 100 μL를 놓습니다.
- parafilm의 접시를 넣어.
- 하룻밤 냉장고에 접시를 놓습니다. 번호판 주간 좋다. 엄지의 규칙은 우물에 액체가 남아 아직도있다면 접시가 사용될 수있다는 것입니다.
셀 준비
PBMCs가 신선면 37 세포를 포함하고 밤새 품어 ° C를 5 % CO 2. PBMC에 대한 세포의 해동하는 것이 필요하다, 액체 질소에 저장됩니다. 다음과 같이 프로토콜은 다음과 같습니다 :
- 37 거의 완전히 해동 때까지 ° C의 물을 욕조에있는 세포의 cryovial을 해동.
- 즉시 R10 미디어 5 ML에 resuspend.
- 225 X G.에서 5 분 스핀
- R10 미디어 5 ML 다시 Resuspend와 trypan 파랑을 사용하여 가능한 세포를 계산합니다.
- R10 미디어 2 X 10 6 세포 / ML에 집중을 가져와.
- ° C와 5 % CO 2 37 하룻밤 휴식.
일 2 : 설정 - 업 플레이트
- 표본 식별 번호, 잘 조건 및 날짜와 함께 레이블 플레이트 뚜껑.
- 덤프 및 얼룩 방법을 사용하여 살균 1X PBS 150 μL와 접시 6 번 씻으십시오. 덤핑 동안 번호판을 시작하지 않도록주의하십시오. 이것은 접시의 우물은 보라색 회전시킬 수 있습니다.
- 각 잘하는 R20 100 μL를 추가합니다.
- 37 판 ° C 1 시간을 품어.
- 접시 잠복기지만, 하룻밤 푹 있던 세포를 계산합니다.
- 5 분 1,500 RPM의 세포 현탁액을 스핀. 뜨는을 가만히 따르다하고 R10 미디어 1mL 당 1X10 6 세포의 최종 농도가되도록 펠렛을 resuspend.
- 1 시간 부화 후, 제거 R20 덤프 및 얼룩 방법을 사용합니다. 덤핑 동안 번호판을 시작하지 않도록주의하십시오.
- 각 잘하는 세포 솔루션을 100 μL를 (10 5 셀)을 추가합니다. 중복의 해당 우물에 적절한 펩티드 및 / 또는 항원을 추가합니다. 새로운 피펫 팁 당신이 펩타이드 작업 솔루션에 갈 때마다 사용하십시오. 일반 펩타이드 농도는 10-40 μg / ML입니다. 펩티드가 다르므로, 각 수사관이 최적의 결과를 얻을 펩티드를 적정하다해야합니다.
- 부정적인 제어 우물에서 유일한 세포를 (없음 펩티드) 추가
- 긍정적인 제어 우물에서 phytohemagglutinin을 (; 10 μg / ML, 시그마 PHA)을 추가합니다.
- 37 밤새 품어 ° C 5 % CO 2와 (과 ~ 18 시간).
3 일 : 플레이트 개발
- 덤프 및 얼룩 방법을 사용하여 150 μL 1xPBS와 접시 6 번 씻으십시오.
- 멀티채널 pipettor를 사용하여 판의 각 잘 ~ 100 μL PBS를 추가합니다.
- 15 분 냉장고에 접시를 넣어.
- 냉장고에서 꺼내 접시를 타고 조직 문화 후드에 놓으십시오.
- 비오틴 항체 솔루션을 준비
- 11mL PBS에 0.5 μg / 비오틴 항체의 ML을 (mAB 7 B6 - 1) 추가합니다.
- 잘 섞어 소용돌이 솔루션입니다.
- 다채널을 사용하여 솔루션을 추가할 계획하면 저수지에 잔.
- 휴지통으로 그것을 flicking하여 PBS를 폐기하십시오. 덤핑 동안 번호판을 시작하지 않도록주의하십시오.
- 각 우물에 솔루션을 100 μL를 놓습니다.
- 한 시간 만이라도 실내 온도에서 조직 문화 후드에 금속판을 품어.
- 덤프 및 얼룩 방법을 사용하여 150μL 1xPBS와 접시 6 번 씻으십시오. 당신이 Streptavidin 항체를 준비 때까지 6 번째 세척에서 접시에 PBS를 두십시오.
- Streptavidin 항체를 준비합니다.
- 11mL PBS (1:2000 희석) 5.5 μ 리터 Streptavidin 항체 (Streptavidin - 알프)를 추가합니다.
- 잘 섞어 소용돌이 솔루션입니다.
- 다채널을 사용하여 솔루션을 추가할 계획하면 저수지에 잔.
- 우물에 남아있는 PBS를 삭제하고 번호판을 가릴.
- 각 잘하는 Streptavidin 솔루션을 100 μL를 추가합니다.
- 1 시간 동안 실온에서 조직 문화 후드에 금속판을 품어.
- 접시 PBS는 덤프 및 얼룩 방법을 사용하여, 6 번 씻으십시오. 당신이 컬러 솔루션을 만들 때까지 6 번째 세척에서 접시에 PBS를 두십시오.
- 어둠 속에서 작동합니다. 알칼리성 인산 가수 분해 효소 기판 솔루션 (알카라인 인산 가수 분해 효소 기판 키트 IV BCIP / NBT) 준비 :
- 기판 시약 1-11 ML 트리스 버퍼 잘 와동 4 방울을 추가합니다. 트리스 버퍼 잘 소용돌이에 기판 시약이 4 방울을 추가합니다. 트리스 버퍼 잘 소용돌이에 기판 시약 3 4 방울을 추가합니다.
- 나머지 PBS를 무시하고 번호판을 가릴.
- 다채널을 사용하여 접시의 각각 잘 수있는 색상의 솔루션을 100 μL를 추가합니다.
- 색상 5~10분가 개발 후 불을 켭니다.
- 명소 보라색을 설정하는 시작하고 매우 어두운 때까지 색상 시약은 접시에 남아 수 있습니다. 이것은 5에서 20 분 거리에 걸릴 것입니다. 이렇게하면 높은 배경을 일으킬 수 있기 때문에 너무 오래에서 기판 솔루션을 떠나지 않도록주의하십시오.
- 수돗물로 ELISPOT 판에게 3 번 씻으십시오.
- 한 시간이나 야간을 위해 건조에 둡니다.
- 수동 또는 ELISPOT 플레이트 리더와 플레이트를 참조하십시오.
- 가벼운 노출 멀리 상자에 접시를 저장합니다.
대표 결과 :
ELISPOT는 미생물 항원에 대한 면역 반응을 quantitate하도록 설계되었습니다. 각 지점의 관심 시토킨 표현, 단일 세포 응답을 나타냅니다. 장소는 수동으로 또는 ELISPOT 플레이트 판독기를 사용하여 계산하실 수 있습니다.
ELISPOT가 올바르게 수행되었는지 평가는 관심의 시토킨의 배경 제작에 대한 부정적인 제어 조사로 시작한다. 약간의 배경 (보라색 색상)이있을 수 있지만 부정적인 제어 우물에서 하나는, 아무 반점을 볼 수있을 거라고 기대합니다. 일반적으로 잘 따라 오 명소 평균 이하가되어야합니다. 긍정적인 제어 우물은 반응이 제대로 수행되었는지 확인하고, 전지 antigenic의 자극에 반응하는. 긍정적인 제어 우물에서는 관광 명소 (Fig1)의 합류로 인해 깊은 보라색 배경을 보여야하는데. 없음 흰색 배경에 조금이 있어야합니다. 긍정적인 제어 및 대조군 샘플 적절한있다면, 하나는 다음 관심의 항원을 포함하고있는 우물을 계산하실 수 있습니다. "suboptimal"결과는 높은 배경 (우물은 자주색), 아니 명소 또는 거의 명소, 빈 센터, 저조한 정의 반점 또는 합류 관광 명소로 반영됩니다. 문제 해결 팁 목록 (표 1) 제공됩니다.
그림 1. ELISPOT 판의 대표. 각각의 플레이트는 긍정적인 컨트롤, 대조군 두 우물에 최소한의 관심 실시 펩티드를 포함해야합니다. 딥 퍼플 색상, 합류 세포 거의 모든 흰색 배경이 당신이 볼 수 있듯이 C9, C10, D9과 D10은 긍정적인 제어 우물입니다. 부정적인 제어 우물은 G11, G12, H11 및 H12 있습니다. 이 우물은 보라색 배경과 예상 없음 명소가 없습니다. 명소 G7, G8, H7 및 H8은 미생물의 펩티드로 세포 반응을 설명하고, 자주색 반점이 관심 시토킨을 표현하는 하나의 세포 응답을 나타냅니다.
표 1
| 관찰 | 가능한 문제 | 가능한 솔루션 |
| 하이 배경 | 1. 막 양쪽 제대로 씻어 없습니다 2. 너무 많은 세포의 secreting의 시토킨 3. 플레이트가 제대로 건조되지 4. 개발 판 이상 | 1. 컬러 개발 이전과 이후 증류수와 함께 막의 양면을 씻으십시오. 시약은 접시의 바닥으로 세포막을 통해 누설 수 있으며, 씻어하지 않을 경우 이들은 높은 배경을 일으킬 수 있습니다. 2. 물론 당 세포의 수를 감소, 이것은 최적화가 필요합니다 3. 읽기 전에 접시 이상 건조 4. 개발 시간을 단축 |
| 관광 명소 없음 / 거의 명소 없음 | 1. secreting의 시토킨 / 관심의 단백질 충분하지 세포의 2. 세포가 제대로 자극되도록 3. 내 말 좀 incubated하지 세포충분히 긴 사연 또는 흥분제에 응답하는 시간이 오래 걸릴 수 있습니다 4. 부적 절한 컬러 개발 5. 충분한 기본 또는 보조하지 항체 | 1. 세포의 수를 늘립니다. 이것은 최적화가 필요합니다 2. 당신이 시토킨 / 관심 단백질의 표현을 유도합니다 알고 흥분제 - 또한 긍정적인 자극의 컨트롤을 사용 3. 세포 배양 시간을 늘리거나 간접적 방법 (자극과 사전 치료 전지)를 사용 4. 오버헤드 현미경으로 컬러 개발을 모니터링하고 개발 시약이 올바르게 저장되었습니다 활동을 잃었하지 않도록 5. 기본 및 / 또는 보조 항체의 농도가 증가해야합니다. 이것은 최적화가 필요합니다. |
| 빈 영역 | 1. 막 미리 처리하지 2. 막 어떤 단계에서 밖으로 건조했다 3. 세포는 unevenly 배포 | 1. 확인 막은 충분히 70 %의 에탄올 (모든 점막이 너무 귀하의 공급 업체에 확인하지 않아도)와 pretreated 있습니다. 나중에 PBS 배와 잘 씻으십시오 2. 막 건조되지 않도록 3. 당신이 우물 밖으로 pipetting 전에 좋은 동종 세포 현탁액을 가지고 부드럽게 세포를 섞어 확인 |
| 빈 센터 | 1. 세탁 피해 | 1. 자동 와셔 (또는 pipetting)에 유량이 너무 높은 수 있습니다. 보다 부드러운 세척 절차를 필요 |
| 잘못된 반응 | 1. 차 항체 집계 2. 아직 막에 셀 3. 세포 배양 오염 | 1. 보조 항체를 필터 2. 모든 세포가 이차 항체 부화하기 전에 PBS 트윈 20과 멤브레인에서 세탁 있도록. 멤브레인 왼쪽 세포는 불규칙한 모양의 반점를 제공합니다 3. 살균 및 가능한 한 깨끗한 등 시약 보관하십시오. 당신의 세포 배양 기술은 무균 있는지 확인하십시오. 미디어 부정적인 컨트롤을 실행하여 잘못된 반응 있는지 확인합니다. 판 운동, 제대로 정의 명소를 참조하십시오 |
| 콘플루앙 명소 | 1. 불쌍한 코팅, 너무 많은 항체 2. 연장 세포 배양 3. 세포가 과잉 자극 | 1. 기본 항체 농도를 줄입니다 2. 더 이상 세포가 incubated 있으며, 더 시토킨 / 단백질들이 분비됩니다. 이것은 합병과 분간이 될 시작합니다 더 큰 장소가 발생합니다. 3. 세포 배양 단계 배양 시간을 줄일 수 있습니다. 이상 - 자극이 시토킨 / 세포에 의해 분비되는 단백질이 많이 발생합니다. 이것은 합병과 분간이 될 시작합니다 장소를 생산합니다. 시간이 짧은 금액에 대한 문화 미디어 또는 문화에 자극의 양을 줄이기 |
| 저조한 정의 명소 | 1. 멤브레인 아니라 사전 처리는 (귀하의 세포막이 필요한 경우, 공급 업체에 문의하십시오) 2. 세포 배양 중에 플레이트의 움직임 | 1. 막은 에탄올 또는이 퍼지, 저조한 정의 명소가 발생할 수 있습니다 사전 취급해야합니다. 독자가 이들을 구별하는 것은 어려운 것입니다 2. 이사 세포가 두 개 이상의 자리를 만들 수 있으므로 접시 세포 배양 중에 이동하는 것을 허용하지 않습니다. 가능한 부화하는 동안 공개되지 않습니다 전용 배양기를 사용하는 경우. 세포를 추가한 후 번호판을 탭하지 마십시오 |
| 긍정적인 제어 우물이 낮습니다 | 1. Underdevelopment가 - 실내 온도로 이동되지 않은 Streptavidin - 알프 및 / 또는 BCIP / NBT 솔루션을 사용하여 결과 수 있습니다 | 1. 우물에 추가하기 전에 실내 온도에 시약 가져와 |
| 명소 밀도는 어려운 그들을 계량 수 있습니다 | 1. 너무 많은 세포가 우물에 추가되었습니다 | 1. 뚜렷한 반점 형성집니다 세포의 최적의 수를 결정하는 세포의 dilutions (예 : 1, 물론 당 × 10 6, 5 × 10 5, 1 × 10 5, 5 X 10 4, 1 X 10 4 세포)를 만들 |
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Discussion
ELISPOT 분석은 인간의 면역 반응을 모니터링하는 가장 중요하고 널리 사용 assays의 하나로서 등장과 다른 종의 다양한 있습니다. ELISPOT 분석과 함께, 면역 세포 주파수는 세포 집단의 확장이나 조작없이 단일 세포 수준에서 측정할 수 있습니다. ELISPOT 분석 널리 감염증, 암, 알레르기 및 면역 질환 등 다양한 질병의 항원 특정 면역 반응을 조사하기 위해 적용되었습니다. 이 분석의 응용 프로그램은 크게 항원 특정 세포의 부량 중요한이나 항생제 치료 1 일 이전이나 이후 결핵 등 다양한 질병 상태에서 특정 항원에 대한 면역 반응의 비교는 연구에 적용되었습니다. 그러나, 최근의 보고서는이 같은 분석은 ascitic 유체, 대뇌 척수 또는 bronchoalveolar 세척과 같은 절연 재료 세포 내에서 항원에 특정한 T 세포의 주파수를 감지하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. 성 - 한 김 동부 표준시. 알. 복부 결핵 의심 환자에서 PBMCs에서 ELISPOT 분석을 사용하여, 적극적인 복부 TB 2 진단위한 89%의 감도있다는 것을 보여주었다. 또한 T - 세포 기반 ELISPOT 분석은 말초 혈액과 중추 신경계 mononuclear 세포 3을 사용 결핵에 의해 중추 신경계의 참여 의심 환자에 적극적으로 TB의 진단을위한 91% 감도 있다고 보여왔다. 저희 연구실은 sarcoidosis 환자의 PBMC에서 mycobacterial 항원 ESAT - 6 세포 인식을 평가하기 ELISPOT 분석을 활용합니다. 그것이 ELISPOT 분석이 4,5 특발성 질환의 전염성 요원들의 역할을 윤곽을 그리다하는 진단 방법으로 사용될 수 있습니다 방법을 보여줍니다 때문에이 보고서는 중요합니다. 이 분석의 또 다른 장점은 또한 BCG 접종을받은 환자에서 결핵의 식별을 허용합니다. 분석은 같은 스테로이드 사용과 HIV 감염 6으로 immunosuppressive 조건에 의해 제한되지 않습니다. 그것은 또한 인간 면역 결핍 바이러스의 부량 및 특성 (HIV)에 특정한 CD8 + T 세포 반응 7 촉진하고 있습니다. 응답은 심지어 Aspergillus fumigatus 8로 미생물 항원에 건강한 과목 중에서 검색하실 수 있습니다. ELISPOT도 Hantavirus 심폐 증후군 9,뿐만 아니라 만성 HIV 감염 10 동안 T 세포 기능을 평가하기 위해의 생존자에서 immunodominant 항원을 식별하는 데 사용되었습니다. 때문에 체외 문화에 단기의 측정 응답이 밀접하게 생체내 T 세포 주파수의 거울. ELISPOT 분석에는 lymphoproliferation 분석 (LPA)와 세포 독성 T 림프구 (CTL) 분석으로 '표준'T 세포 assays 중에서 가장 낮은 검출 한계가 있습니다. 이 요약은 비교적 간단하고 저렴한 분석의 광대한 가능성 한정보기를 제공합니다. 이 분석의 가능한 응용 프로그램 확장을 계속합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
연구 자원, 보건 국립 연구소를위한 국립 센터에서 밴더빌트 CTSA 부여 한 UL1 RR024975에 의해 부분적으로 지원. 이 작품은 NIH R01 HL 83839에 의해 투자되었다; R01 AI 65,744합니다.
Materials
A. Preparation of Media |
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B. Preparation of Tris Buffer |
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C. Materials necessary for ELISPOT analysis: |
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References
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