Summary
시신경의 절개면은 성인 CNS 손상의 널리 사용되는 모델입니다. 망막 신경절 세포의 90 퍼센트 (RGCs)은 누구의 axons 완전히 axotomy 후 14 일 이내에 죽는 (axotomy) 그었 있습니다. 이 모델은 실험 조작을 쉽게받을 수있는 고도 재현할 수 있습니다.
Abstract
망막 신경절 세포 (RGCs)는 CNS의 뉴런되는 시신경을 통해 뇌로 망막의 출력 영상 정보. 시신경은 안구의 궤도 내에서 액세스하고 완전히 전체 인구의 RGC axons를 절단 (axotomized) 그었 수 있습니다. 시신경의 절개면은 성인 CNS 1-4에서 apoptotic 세포의 연결을 죽음의 재현성 모델입니다. 눈 유리체 챔버가 intraocular 주사를 통해 실험 조작을 허용, 망막에 약물 전달 캡슐 역할을하기 때문에이 모델은 특히 매력적입니다. 유리 체액을 통해 화학 물질의 확산들은 전체 인구 RGC에 따라 행동을 보장합니다. 또한, RGCs은 선택적으로 그들의 목표는 우수한 colliculus 8로 시신경 5-7 또는 주입 벡터의 컷 끝에 짧은 방해 RNAS (siRNAs), plasmids, 또는 바이러스성 벡터를 적용하여 transfected 수 있습니다. 이것은 연구자들이 다른 방관자의 뉴런이나 주변 glia에 혼란함을 주죠 효과없이 원하는의 연결 인구 apoptotic 메커니즘을 공부하실 수 있습니다. 추가 혜택 세포 생존이 부상 후 계량 할 수있는 쉽고 정확성이다. 망막은 평평 계층 조직이며 RGCs는 내면 레이어, 신경절 세포 레이어에 현지 있습니다. RGCs의 생존은 axotomy 시에 시신경의 절단 끝에 형광 추적기 (3 % Fluorogold)을 적용하여, 또는 우수한 colliculus (RGC 대상)하기 전에 일주에 추적기를 주사하여 시간이 지남에 따라 추적할 수 있습니다 axotomy. 추적기는 retrogradely 전체 RGC 인구 라벨, 수송이다. 신경절 세포 레이어가 monolayer (두꺼운 한 셀)이기 때문에 RGC 밀도는 stereology 필요없이, 평면 장착 조직에서 계량하실 수 있습니다. 시신경의 절개 14 일 postaxotomy 9-11 이내에 부상 RGCs의 90 %의 apoptotic 죽음에 이르게한다. RGC apoptosis는 세포 죽음은 세포가 빠르게 타락한 이후 3~4일의 postaxotomy을 지연 의하여 시간 코스 특성이 있습니다. 이것은 apoptosis에 관련된 경로에 대한 이동 실험 조작을위한 시간 창을 제공합니다.
Protocol
1. 외과 기술
- 실험 무균 기술을 사용하여 특정 기관의 동물 사용 프로토콜에 따라 수행하여야한다. 살아있는 조직과 접촉으로 오는 악기와 자료 (솔루션, 시험 물질, 추적기, 바늘 등) 동물 복지 및 연구에 대한 잠재적인 부정적 영향에 감염하고 불리한 영향을 방지하기 위해 멸균해야합니다.
2. 마취
- 쥐 한 동물 isoflurane 기화기 시스템을 사용 anaesthetized 것입니다. 0.8 L / isoflurane 가스를 기화하는 분의 비율로 의료 학년 산소를 사용하십시오. 첨부된 마취 상자에 동물을 배치하고 호흡이 둔화하고 있으며 동물이 진정 될때까지 4퍼센트의 isoflurane 농도에 전화.
- 다음, stereotaxic 프레임 가스 마스크 첨부 파일에 가스 흐름을 스위치와 stereotaxic 장치에 동물을 놓으십시오. 2 % isoflurane 농도를 켜고 마취를 모니터링합니다. 큰 동물 (> 300g)는 isoflurane의 높은 농도를 필요로 할 수 있습니다. 마취는 수술 중에 모니터링하고 isoflurane 복용량이 적절하게 조정해야합니다. 깊이와 호흡 속도는 지속적으로 평가해야하고, 깊은 고통의 부재에 대한 발가락 핀치 평가 (매 5 분)을 수행하여야한다.
- 수술이 완료되면, isoflurane을 해제하고 stereotaxic 장치에서 제거하기 전에 몇 분 동안 호흡 산소에 동물을 허용합니다. 체온은 수술 담요 및 / 동물을 포함하거나 수술하는 동안 규제 난방 담요를 사용하여 유지 관리해야합니다.
3. 외과 어프로치
- 컷에 털이 쉽게하기 위해 70 %의 에탄올과 함께 머리 위에 털이 젖었어. 클리퍼 또는 날카로운 가위를 사용하여 두 눈 사이에서 모피를 제거합니다. 70 % 에탄올 다음 요오드 세제 솔루션의 응용 프로그램을 번갈아 가며 (Proviodine, Betadine 등)와 절개 지역 세 번 청소합니다. 각막에 안과 안과 연고 (눈물 Naturale PM)을 적용하여 수술 내내 촉촉한 각막을 유지합니다. 수동으로 눈꺼풀을 열고 닫는하여 각막의 표면 위에 연고를 펴.
- 11 호 블레이드를 사용하여 눈 뒤에 1cm로 눈앞에서 약 0.5 cm의 머리의 정중선을 따라 절개합니다. 포셉를 사용하여 눈 위에 피부의 플랩을 접어야하고 부드럽게 메스의 뒤에있는 근본적인 결합 조직 멀리 애타게. 그런 다음, 옆으로 아래로 피부를 철회하고 stereotaxic 악기의 기본에 매달 수있는 수술 견인기와 장소에서 개최.
- 날카로운 집게로 overlying의 근막에 당기면서 궤도 뼈의 우수한 림을 따라 절개를합니다. 이것은 안구의 궤도를 overlying 근막을 철회합니다. 궤도 뼈의 가장자리 명확하게 궤도를 overlying 근막 아래로 밀어 집게를 사용하여 demarcated 수 있습니다. 소작 장치 또는 메스를 사용하여 안구의 궤도의 사후 제한을 향해 뒤로 절개를 계속합니다. 절개를위한 가이드로 뛰어난 궤도의 뼈를 사용하십시오. 다음 궤도의 앞쪽에 제한쪽으로 절개의 전달을 계속합니다. 우수한 궤도의 절개는 가장 정맥 sinuses와의 의사 소통의 기본 혈관의 출혈을 방지하기 위해 작은 소작 장치를 사용하여 수행됩니다.
- 출혈이 발생하면 몇 단계를 취할 수 있습니다. 첫째, 무균 수술 면봉이나 솜 면봉을 사용하여 압력을 적용합니다. 출혈이 계속되면, 스포이트를 사용하여 지역 감기, 멸균 인산 완충 생리 (PBS)를 적용하고, 압력을 유지합니다. 사소한 출혈이 절차를 사용하여 몇 초 후에 중단됩니다. 출혈이 지속되면 출혈의 원인을 파악하고 신속하게 손상된 혈관을 부식하기 위해 수술 면봉이나 면봉으로 조직에 견인을 적용합니다. 출혈이 포함된 후, 혈액의 외과 영역을 청소 추위 멸균 PBS를 사용합니다. 외과 영역 정기적으로 더 눈 궤도에 구조를 시각화하기 위해이 방식으로 청소해야합니다.
- 절개가 청소가 완료되면, 궤도 내용을 overlies 눈 뒤쪽에있는 결합 조직을 청소 집게와 메스의 뒷면을 사용합니다. 끝 괜찮아와 같이 11 호 메스의 다시 잘 작동합니다. 이것은 궤도 캐비티가 궤도에 구조 조작에 이상적입니다 그들의 곡률과 훌륭한 조언으로 눈을 작업할 때 사용 더몬트 #의 7B 날카로운 곡선 - 톱니 모양의 집게 안으로 작업하는 큰 수술 창을 제공하는 더 깊은 부분을 열립니다. 또한, 잘린 자리가 재밌 구조를 도와줍니다.
- 다음, 정중선 근처에 앉아 삼차 신경의 안과 부문을 둘러싸는 결합 조직을 제거하고, 집게를 사용하여 신경을 제거합니다. 이 단계는 필요하지 않습니다, 그러나 신경을 제거하면 엑서스의 큰 창문을 제공합니다나중에 시신경의.
- 신경의 제거에 따라 아래의 혈관을 철회하는 집게를 사용하여 완전히 혈관을 부식. 이 단계도 필요하지 않습니다, 그러나 선박의 소작은 그것이 시신경에 도달하면이를 더 큰 창문을 만들어 anteriorly 이동할 수 있습니다.
- 자신의 도움말을 조심스럽게 extraocular 근육과 lacrimal 선 이상의 결합 조직의 얇은 레이어를 선택하고 제거하는 안으로 구부 러가 있었 날카로운 집게의 쌍, 또는 집게를 사용하십시오. 궤도의 후부에 앞쪽에에서 추가 안구 근육을 철회. 포셉 한 쌍의과 근육의 근위 부분을 손잡이와 근육에 외부 견인을 적용하기 위해 곡선 톱니 아이 드레싱 포셉의 두 번째 쌍을 사용합니다. 찢어진 방지하기 위하여 당기 때 눈 드레싱 포셉는 근육과 같은 방향으로 지향하고 있는지 확인합니다. 이러한 방식으로 궤도 (우수 경사)의 가장 앞쪽에 근육을 제거합니다. 근육은 궤도 내의 깊은 곳에서 해방되고 남은 길이가 밖으로 시선을 회전하기 위해 철회하실 수 있습니다.
- 눈 등의 표면의 정중선 근처 lacrimal 글랜드 및 Harderian 수유기의 엽 (叶) 사이에있는 다음 근육 (중간 Rectus)와 3.8 단계를 반복합니다. 근육에 견인을 유지하기 위해 견인기 아래 테이프.
- 부드럽게 lacrimal 선의 표면 위에 남아있는 결합 조직을 제거하고 집게를 사용하여 상향 선을 리프트. 글랜드를 압축하거나 짠다하지 마십시오. 글랜드을 철회하기 위해, 뒷부분 기둥에 단지 하나의 우주선이 불로 지졌죠해야합니다. 상향 선의 후부 끝을 리프트 다음 혈관을 부식.
- 다음 궤도의 후부 부분을 열고 시신경을 ... 위에 가로 눕다 근육에 unimpeded 액세스를 허용하도록 앞으로 lacrimal 선을 흔들고. 지속적으로 습한 지역 멸균 PBS를 사용하고, 수술 면봉이나 솜 면봉과 건조 유지.
- 날카로운 집게를 사용하면 다시 한 번 후부 궤도 (Levator Palpebrae Superioris 우수한 Rectus)의 근육을 둘러싸는 얇은 결합 조직을 제거하고 근육의 기본 번들을 구분합니다. 곡선 톱니 모양의 아이 드레싱 포셉를 사용하여 개별적으로 또는 한마음으로 근육을 접어야 다시 한번, 근육 섬유과 일치 이겠지. 견인을 적용 견인기 아래 단계 3.8 및 3.9와 테이프의 철회 있던 근육과 함께 견인기에 남아있는 근육 길이를 연결합니다. 4 근육의 총 현재 견인기에 첨부됩니다. 이것은 시신경을 둘러싸는 지방이 들어 칼집을 공개하기 위해 앞으로하고 밖으로 시선을 회전합니다.
4. 시신경을 액세스
- 시신경의 지방 칼집을 둘러싸는 결합 조직에서 위쪽으로 잡아 날카로운 집게를 (좋은 팁 뒤몽)를 사용합니다. 작은 Vannas 스프링 가위를 사용하여 세로 절단하십시오. 필요에 따라 절단을 확장합니다. 절단이 이루어집니다 한번 칼집에 의해 포함된 지방이 밖으로 팽창하기 시작합니다. 다음 조심스럽게 가장자리에서 위쪽으로 당기는 조직의 초승달 모양의 날개를 잘라으로 결합 조직의 펄럭를 제거합니다.
- Vannas 스프링 가위로 절단하면서 지방을 뽑아 집게를 사용하여 지방 overlying 시신경을 제거합니다. 지역 조직의 제거에서 발생하는 혈액의 작은 금액을 청소 살균 PBS, 외과 면봉을 사용하여 깨끗하게 유지.
- 시신경은 이제 볼 수 있습니다. 신경에 접근하기 위해서는 신경을 둘러싸는 meningeal 껍질은 안쪽 망막 피드 안과 동맥을 손상없이 제거해야합니다. 부드럽게 칼집을 회전 집게를 사용하여 meningeal 칼집의 혈관 패턴을 검사합니다. 혈관은없는 영역을 찾아, 그리고 meningeal 칼집에서 만든 것으로 길이 상처를 허용.
- 좋은 팁 더몬트 집게를 사용하여 두라을 공략하고 위쪽으로 당기십시오. 만들어 두라의 삼각형 모양의 쐐기의 기본 근처 칼집에 작은 절개를 만들기 위해 Vannas 스프링 가위를 사용합니다. 절개로 가위의 낮은 날개를 삽입하고 측면 인하로 vasculature을 손상하지 않도록주의 시신경의 방향에 칼집의 병렬 잘라. 시신경의 양쪽에있는 두라를 내리면 t에 포셉 및 가위를 사용합니다.
- 신경의 유일하게 남은 보상은 거미집 모양의 막이다. 매우 얇고 투명합니다. 멤브레인가 여전히 존재하는지 확인하기 위해 신경의 표면을 공략하기 위해 날카로운 집게를 사용합니다. 거미집 모양의이 존재 그것은, 멤브레인을 공략하고 조직의 삼각형 쐐기를 만들 위쪽으로 당기십시오. 4.4 단계로 유사한 가위 끝에있는 작은 절개를합니다. 그런 다음 가위의 낮은 날개를 삽입하고 거미집 모양의에 세로 절개를합니다. 다음, 시신경의 양쪽에있는 거미집 모양의를 내리면 t에 가위와 집게를 사용합니다.
- 마이크로 - 쓔흐를 사용하여gical 후크는 meningeal 칼집 밖으로 시신경을 향상. 신경의 바깥쪽 가장자리 주위의 후크의 끝부분을 통과하고 당신은 후크와 meningeal 세포막을 잡으면 그리고 실수로 그들을 가로로 쪼개다하지 않도록 후크가 신경 접촉 숙박 있는지 확인하십시오. 부드럽게 meningeal 칼집 밖으로 시신경을 들고 완전히 후크 지원 지점 뒤에있는 신경을 가로로 쪼개다. 가로 시신경 스텀프 이제 후크의 제거를위한 수 있도록 무료로 끝이됩니다.
- RGCs가 retrogradely 생존을 계량하기 위해 표시 될 경우, 가로로 시신경 스텀프 (참조 이상 (또는 다른 역행 추적) 3 % Fluorogold에 배어 gelfoam의 작은 조각을 배치 조브 프로토콜 2,261를 .)
5. 폐회 및 복구
- 추가 안구 근육의 견인을 완화하고 중립적인 위치로 시선을 반환합니다. 이렇게하는 동안, 눈이 다시 자리로 회전으로 gelfoam은 시신경 스텀프 주위에 남아 있도록 눈의 궤도에 gelfoam을 밀어 있는지 확인하십시오. 그들의 자연적인 위치로 lacrimal 글랜드 및 추가 안구 근육을 반환합니다.
- 정중선에 피부를 반환하고 상처를 봉합. 양쪽 눈 안과 안과 연고를 적용합니다. 그런 다음, isoflurane 소스를 끄고 몇 분 동안 호흡 산소에 동물을 허용합니다. 복구 열 램프 아래 가열 새장이나 새장에 동물을 배치합니다. 복구하는 동안 침구를 aspirating의 기회를 제거하는 복구 케이지에 이불을 올려 놓지 마십시오.
- 동물은 수술 후 독립적으로 지내게 될 것입니다. 포스트 외과 진통제는 동물 의료 기관의 지침에 따라 관리되어야하고, 동물은 신중하게 수술 후 모니터링해야합니다.
6. 대표 결과 :
14 일 이내에 부상 RGCs의 90 %의 손실 postaxotomy 9-11에서 시신경 결과의 절개. RGC 사망의 주요 메커니즘 apoptosis 9, 12. RGCs의 정상적인 밀도는 약 2,500 세포 / mm 2. Epifluorescence 또는 공촛점 이미징은 axotomy 후 retrogradely 분류 RGCs을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. RGC의 apoptosis는 실험 조작을위한 시간 창 떠나, axotomy 후 약 4 일까지 지연될 수 있습니다. axotomy 및 Fluorogold와 역행 라벨 후 1 일, 망막의 신경 섬유 층의 망막과 축삭의 fascicles의 신경절 세포 레이어에 RGC 세포 기관은 분명히 볼 때 이미지 flatmounted 준비 (그림 1A). axotomy 후 14 일에 의해 RGCs의 대부분이 사망하고, 몇 가지 남아 RGCs는 망막 microglia (그림의 1B) 사이 interspersed 있습니다. RGCs는 apoptosis, microglia phagocytose 죽은 세포와 transcellularly RGCs 13, 14 라벨에 사용하던 형광 추적기으로 표시되는 결과로 받아야하는 경우. microglia의 phagosomes에 추적기의 모습은 생존 RGCs에서 다릅니다. Microglia는 비교적 큰 그들의 세포질 (그림 1C) 곳곳에 퍼져 있습니다 고농도 매우 밝은 phagosomes에 추적기가 포함되어 있습니다. RGCs는 retrogradely 세포 세포질을 제출 자신의 axons을 수송했습니다 작은 작은 반점이있는 vesicles와 얼룩의 더 확산 패턴 (그림 1C)가. 이러한 vesicles 훨씬 작은 있으며 하나는 microglia에서 살아남은 RGCs을 차별화 수 있도록 덜 강렬한 형광 있습니다. 또한, microglia 많이 작은 세포 기관을 가지고 있으며 상대적으로 크고 둥근 세포 기관을 가지고 RGCs 반대로 별 모양 또는 amoeboid 형태를하는 경향이 있습니다. RGCs의 돌기 나무는 세포 생존을 quantifying 때, microglia의 짧은 밝은 과정에서 그들을 차별 도움이 될 수 있습니다. 세포 생존은 망막의 다른 지역에서 계량 수 있으며 RGCs은 신경절 세포 레이어 내에서 monolayer에서 발견 있기 때문에 밀도 (세포 / mm 2) 해당 micrographs의 지역에서 추정하실 수 있습니다.
그림 1. 시신경 스텀프에 추적기의 axotomy 및 응용 이후 Fluorogold 분류 RGCs의 Epifluorescence micrographs. (A) axotomy의 RGCs 및 축삭의 fascicles 이후 일일은 좋은 작은 반점이있는 방식으로 추적으로 표시됩니다. (B) axotomy 후 14 일으로 RGCs의 90 %는 죽은 세포도 추적기로 표시 아르 phagocytosed이 microglia 돌아가시고 밝은 분류했습니다. (C) 높은 배율은 14 일 postaxotomy에서 RGCs와 microglia (레드 화살촉)의 차이를 보여주는. 스케일의 바, B는 50 μm의 수 있습니다. C의 스케일 바는 25 μm의 수 있습니다.
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Discussion
이이 수술의 많은 변형이 있고이 프로토콜의 단계에 몇 가지가 필요하지 않습니다. 단지 신경에 액세스하기 위해서는 시신경을 ... 위에 가로 눕다 근육을 철회할 필요가 있습니다. 그러나, 신경 주위에 매우 제한된 작업 공간이 결과는 절개의 중요한 마지막 단계 더 어렵게 만듭니다. 어떤 상황에서는 그것은 시신경 스텀프에서 세포와 extraocular 근육과 lacrimal 선의이 인스턴스에서 유용합니다 retracting하여 여유 증가 액세스 공간을 transfect하는 것이 바람직하다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 단계 4.3-4.6입니다. 시신경의 머리 주위 vasculature을 손상하지 않는 것이 중요합니다. 신경은 안쪽 망막에 눈 및 피드 혈액 mm 하나에 신경을 침투 안과 동맥에 손상을 방지하기 위해 안구 뒤쪽 1.5-2.0 mm을 가로로한다. 따라서 안과 동맥 눈 손상의 뒤쪽에서 작은 작동 거리를 유지하여 피할 수 있습니다. 망막은 일반적으로 투명하고 혈관이 명확하게 demarcated 수 있습니다. 망막 혈액 공급이 손상된 경우 망막은 밀키 흰 응집의 모습으로 최고의 타락한 것입니다. 눈과 렌즈의 유리 챔버는 일반적으로 눈이 시간이 지남에 따라 크기 감소와 함께,뿐만 아니라 이상의 구름 것입니다.
연습, 전체 수술의 모든 단계는 초기 진입 삭감이되었습니다되면, 눈 당 10~15분에서 수행할 수 있습니다. 절차는 또한 궤도에 접근 측면에서 성취하거나, 경로가 연구자의 선호에 따라 절차 변경에 매우 의무 수있다. 이 모델은 세포 죽음의 높은 재현성 시간 코스를 가지고 있으며 전세계적으로 망막을 대상으로 또는 직접 세포 생존에 실험 트리 트먼트의 효과를 테스트하기 위해 부상 RGCs을 대상으로 여러 가지 방법이 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
PDK는 CIHR 운영 그랜트 (청소 86,523)에 의해 지원됩니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic Frame | Stoelting Co. | ||
| Rat Gas Mask | Stoelting Co. | ||
| Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Isoflurane (PrAErrane) | Baxter Internationl Inc. | DIN 02225875 | |
| Surgical Microscope | WPI, Zeiss, Leica | ||
| Fluorogold -(Hydroxystilbamidine bis(methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| Gelfoam | Pharmacia Corporation (Pfizer) | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | ||
| Proviodine | Medline Industries | MDS093945H | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Fine tip Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Micro surgical hook | Fine Science Tools | 10062-12 | |
| Eye dressing serrated forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #7b sharp curved serrated forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 |
References
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