Summary
Optic Nerve Durchtrennung ist eine weit verbreitete Modell der erwachsenen ZNS-Verletzung. Neunzig Prozent der retinalen Ganglienzellen (RGC), deren Axone sind vollständig durchtrennt (Axotomie) sterben innerhalb von 14 Tagen nach Axotomie. Dieses Modell ist leicht zugänglich experimentelle Manipulationen und hoch reproduzierbar.
Abstract
Retinalen Ganglienzellen (RGC) sind ZNS-Neuronen, die Ausgabe visueller Informationen aus der Netzhaut zum Gehirn über den Sehnerv. Der Sehnerv kann innerhalb der Augenhöhle zugegriffen werden und vollständig durchtrennt (axotomized), Schneiden der Axone des gesamten RGC Bevölkerung. Sehnerv durchtrennt ist ein reproduzierbares Modell der apoptotischen Zelltod in der erwachsenen ZNS 1-4. Dieses Modell ist besonders attraktiv, weil der Glaskörper des Auges dient als Kapsel für Drug-Delivery auf die Netzhaut und ermöglicht experimentelle Manipulationen via intraokularen Injektionen. Die Diffusion von Chemikalien durch den Glaskörper sorgt dafür, dass sie sich auf die gesamte Bevölkerung RGC handeln. Darüber hinaus können RGCs selektiv, indem short interfering RNAs (siRNAs), Plasmide oder virale Vektoren, um das abgeschnittene Ende des Sehnervs 5-7 oder Injektion Vektoren in ihrem Ziel, dem Colliculus superior 8 transfiziert werden. Dies ermöglicht es den Forschern um apoptotische Mechanismen in der gewünschten neuronalen Population ohne verwirrende Auswirkungen auf andere Zuschauer Neuronen oder Gliazellen um zu studieren. Ein weiterer Vorteil ist die Leichtigkeit und Genauigkeit, mit der das Überleben der Zelle nach der Verletzung quantifiziert werden können. Die Netzhaut ist eine flache, geschichtete Gewebe und RGCs sind in der innersten Schicht der Ganglienzellen lokalisiert. Das Überleben der RGCs kann im Laufe der Zeit durch die Anwendung eines fluoreszierenden Tracer (3% Fluorogold), um das abgeschnittene Ende des Sehnervs zum Zeitpunkt der Axotomie oder durch Injektion des Tracers in die Colliculus superior (RGC target) eine Woche vor verfolgt werden Axotomie. Der Tracer wird retrograd transportiert, Kennzeichnung der gesamten RGC Bevölkerung. Da die Ganglienzellschicht ist eine Monoschicht (eine Zelle dick), kann RGC Dichten in Flach-montiert Gewebe quantifiziert werden, ohne die Notwendigkeit für Stereologie. Sehnerv durchtrennt führt zum apoptotischen Tod von 90% der Verletzten RGCs innerhalb von 14 Tagen postaxotomy 9-11. RGC Apoptose hat einen charakteristischen zeitlichen Verlauf, wobei Zelltod 3-4 Tage postaxotomy, wonach die Zellen schnell degenerieren verzögert wird. Dies ermöglicht ein Zeitfenster für experimentelle Manipulationen gegen Signalwege der Apoptose beteiligt sind.
Protocol
1. Operationstechnik
- Experimente durchgeführt werden sollte unter aseptischen Bedingungen und nach der Nutzung von Tieren Protokolle Ihrer spezifischen Institution. Instrumente und Materialien (Lösungen, Testsubstanzen, Tracer, Nadeln, etc.) in Kontakt mit lebendem Gewebe müssen steril sein, um Infektionen und nachteilige Auswirkungen auf den Tierschutz und mögliche negative Auswirkungen auf die Studie zu verhindern.
2. Anästhesie
- Ratten werden anästhesiert mit einer tierärztlichen Isofluran Verdampfer-System. Verwenden medizinischen Sauerstoff mit einer Rate von 0,8 L / min auf die Isofluran-Gas zu verdampfen. Legen Sie das Tier in der beigefügten Anästhesie-Box und wählen Sie in einer Isofluran-Konzentration von 4% bis zum Atmen hat sich verlangsamt und das Tier beruhigen.
- Als nächstes schalten Sie den Gasstrom auf die Gasmaske Aufsatz für den stereotaktischen Rahmen und Ort des Tieres in den stereotaktischen Apparat. Schalten Sie die Isofluran-Konzentration auf 2% und zu überwachen Anästhesie. Größere Tiere (> 300g) kann eine höhere Konzentration von Isofluran. Anästhesie sollte während der Operation überwacht werden und Isofluran Dosierung entsprechend angepasst werden. Tiefe und Geschwindigkeit der Atmung sollte ständig evaluiert werden, und Zehe Prise Evaluation (alle 5 min) für das Fehlen der tiefen Schmerz durchgeführt werden soll.
- Nach der Operation abgeschlossen ist, schalten Sie die Isofluran und damit das Tier atmen Sauerstoff für einige Minuten vor der Entnahme aus der stereotaktischen Gerät. Die Körpertemperatur sollte durch Abdecken des Tieres mit einem chirurgischen Decke und / oder mit einem geregelten Heizdecke während der Operation beibehalten werden.
3. Chirurgische Vorgehensweise
- Wet das Fell auf der Oberseite des Kopfes mit 70% Ethanol, um das Fell leichter zu schneiden. Entfernen Sie das Fell zwischen den Augenbrauen mit einem Klipper oder eine scharfe Schere. Reinigen Sie den Schnitt Fläche, die dreimal mit wechselnden Anwendungen von Jod Reinigungslösung (Proviodine, Betadine, etc) um 70% Ethanol gefolgt. Pflegen Sie die Hornhaut feucht während der Operation durch die Anwendung Augenheilkunde Augensalbe (Tears Naturale PM) auf die Hornhaut. Verbreiten Sie die Salbe über die Oberfläche der Hornhaut durch manuelles Öffnen und Schließen der Augenlider.
- Mit einer Klinge Nr. 11, einen Einschnitt entlang der Mittellinie des Kopfes von ca. 0,5 cm vor die Augen zu 1 cm hinter den Augen. Ziehen Sie die Klappe der Haut über dem Auge mit einer Pinzette und sanft zu necken sich die zugrunde liegende Bindegewebe mit der Rückseite des Skalpells. Dann Einfahren der Hautlappen seitlich und nach unten und halten Sie ihn mit einem chirurgischen Haken, die an der Basis der stereotaktischen Instrument aufgezeichnet werden können.
- Machen Sie einen Schnitt entlang des oberen Randes des orbitalen Knochen und ziehen auf die darüber liegende Faszie mit scharfen Zangen. Dies wird widerrufen Faszie der Augenhöhle. Der Rand der orbitalen Knochen deutlich mit Pinzette drücken Sie auf die Faszie der Umlaufbahn abgegrenzt werden. Mit einem Brenneisen Gerät oder Skalpell, weiter der Schnitt nach hinten in Richtung der hinteren Grenze der Augenhöhle. Verwenden Sie die Knochen der oberen Bahn als Leitfaden für den Schnitt. Next weiterhin den Schnitt nach vorne in Richtung der vorderen Begrenzung der Augenhöhle. Der Schnitt der überlegenen Bahn erfolgt am besten mit einem kleinen Brenneisen Gerät, um Blutungen aus dem zugrunde liegenden Schiffe, die die Kommunikation mit dem Venensinus zu verhindern.
- Kommt es zu Blutungen in mehreren Schritten ergriffen werden können. Erstens, Druck mit sterilen chirurgischen Tupfern oder Wattestäbchen. Wenn die Blutung anhält, wenden kalten, sterilen Phosphatpuffer (PBS), um den Bereich mit Hilfe einer Pipette und Druck aufrecht erhalten. Leichte Blutungen wird nach einigen Sekunden mit diesem Verfahren zu stoppen. Wenn die Blutung auftritt, gelten Traktion, um das Gewebe mit dem chirurgischen Tupfer oder Wattebausch, um die Quelle der Blutung zu identifizieren und schnell ausbrennen das kompromittierte Schiff. Nach dem Ausbluten enthalten ist, mit kaltem sterilem PBS auf die OP-Bereich von Blut zu reinigen. Der OP-Bereich sollten in regelmäßigen Abständen auf diese Weise gereinigt werden, um besser zu visualisieren Strukturen in der Augenhöhle.
- Nach dem Einschnitt gereinigt worden ist, verwenden Sie Zangen und der Rückseite des Skalpells, um das Bindegewebe an der Rückseite des Auges, dass das Orbital Inhalte überlagert reinigen. Die Rückseite der Nr. 11 Skalpell arbeitet und die Spitze ist in Ordnung. Dies eröffnet tieferen Teile der Augenhöhle die Bereitstellung einer größeren chirurgischen Fenster zu arbeiten in. Verwenden Dumont # 7b scharf gebogenen geriffelten Zangen bei der Arbeit in die Augen, als ihre Krümmung und feinen Spitzen sind ideal für die Manipulation von Strukturen in den Orbit. Darüber hinaus helfen die Verzahnung mit Greif-Strukturen.
- Dann entfernen Sie das Bindegewebe, das die ophthalmicus des Trigeminus-Nervs, die nahe der Mittellinie sitzt umgibt, und entfernen Sie die Nerven mit einer Pinzette. Dieser Schritt ist jedoch nicht notwendig, das Entfernen der Nerv wird einen größeren Fenster des Beitrittss zu den Sehnerv später.
- Nach der Entfernung des Nervs, verwenden Pinzette auf die Blutgefäße unterhalb zurückziehen und vollständig ausbrennen des Schiffes. Dieser Schritt ist auch nicht erforderlich, ermöglicht jedoch Kauter des Schiffes es nach vorne bewegt werden, wodurch ein größeres Fenster, wenn der Sehnerv erreicht ist.
- Mit einem scharfen Zange oder Pinzette, dass ihre Spitzen nach innen gebogen, sorgfältig auswählen und entfernen Sie die dünne Schicht von Bindegewebe in den Augenmuskeln und Tränendrüse zu haben. Ziehen Sie die zusätzlichen Augenmuskeln von anterior nach der Umlaufbahn posterior. Grip im proximalen Teil des Muskels mit einer Pinzette und mit einem zweiten Paar von gekrümmten gezackten Auge Kornzange nach außen Traktion auf den Muskel anzuwenden. Stellen Sie sicher, dass das Auge Kornzange orientiert sind in die gleiche Richtung wie der Muskel beim Ziehen um zu verhindern, zu reißen. Entfernen Sie den vorderen Muskel des Orbits (Superior Oblique) auf diese Weise. Der Muskel wird frei werden von tief in der Umlaufbahn und die verbleibende Länge kann zurückgezogen, um das Auge nach außen zu drehen.
- Wiederholen Sie Schritt 3.8 mit der nächsten Muskel (M. rectus medialis), die zwischen den Lappen der Tränendrüse und Harderschen Gland in der Nähe der Mittellinie der dorsalen Oberfläche des Auges befindet. Band nach der Retraktor Traktion auf die Muskeln zu erhalten.
- Entfernen Sie vorsichtig alle verbleibenden Bindegewebe über die Oberfläche der Tränendrüse und heben die Drüse nach oben mit einer Pinzette. Nicht komprimieren oder drücken Sie die Drüse. Um die Drüse einfahren, muss nur ein einziges Schiff am hinteren Pol zu ätzen. Heben Sie das hintere Ende der Drüse nach oben, und dann ausbrennen des Schiffes.
- Als nächstes Klappe die Tränendrüse uns auf den hinteren Teil der Bahn zu öffnen und ermöglichen ungehinderten Zugang zu den Muskeln, die den Sehnerv überlagern. Halten Sie den Bereich ständig feucht mit sterilem PBS und Trocknen mit chirurgischer Tupfer oder einem Wattestäbchen.
- Mit scharfen Pinzette wieder entfernen die dünne Bindegewebe, das die Muskeln der hinteren Augenhöhle (Levator palpebrae superioris und Superior Rectus) umgibt und trennen Sie die zugrunde liegenden Bündel von Muskel. Ziehen Sie die Muskeln unabhängig oder im Einklang mit den gekrümmten gezackten Auge Kornzange wieder, Ziehen im Einklang mit den Muskelfasern. Bringen Sie die restlichen Muskeln Längen der Retraktor zusammen mit den Muskeln, die in den Schritten 3,8 und 3,9 und Band auf der Retraktor eingefahren wurden, um Traktion anzuwenden. Insgesamt 4 Muskeln werden nun an den Haken befestigt werden. Dies wird das Auge nach vorne und nach außen drehen, um das Fett mit Hülle, die den Sehnerv umgibt offenbaren.
4. Zugriff auf die Optic Nerve
- Scharfe Pinzetten (Fine Spitze Dumont), um nach oben zu ziehen auf das Bindegewebe, dass die fetthaltige Hülle des Sehnervs umgibt. Machen Sie einen Längsschnitt durch kleine Vannas Frühjahr Schere. Erweitern Sie den Schnitt als notwendig. Das Fett durch die Scheide enthaltenen beginnt zu wölben, wenn der Schnitt gemacht wird. Nächstes entfernen Sie die Klappen des Bindegewebes durch vorsichtiges Ziehen nach oben aus dem Rand-und Abschalten der halbmondförmigen Klappen des Gewebes.
- Entfernen Sie das Fett über dem Sehnerv mit einer Pinzette auf das Fett zu ziehen, während des Schneidens mit dem Vannas Frühjahr Schere. Halten Sie den Bereich sauber mit sterilem PBS und chirurgische Tupfer auf die geringe Mengen von Blut, das aus der Entfernung des Gewebes entstehen zu reinigen.
- Der Sehnerv ist nun sichtbar. Um die Nerven zuzugreifen, muss der meningealen Hülle, die den Nerv umgibt, ohne die Arteria ophthalmica, die der inneren Netzhaut-Feeds entfernt werden. Untersuchen Sie die vaskuläre Muster der meningealen Mantel mit einer Pinzette vorsichtig drehen die Scheide. Suchen Sie nach einem Bereich frei von Blutgefäßen und ermöglicht einen Längsschnitt in der meningealen Scheide vorgenommen werden.
- Mit feiner Spitze Dumont Pinzetten, kneifen die Dura und nach oben ziehen. In der Nähe der Basis des dreieckigen Keil der Dura, die erstellt wird, verwenden Sie die Vannas Frühjahr Schere einen kleinen Schnitt in der Scheide zu machen. Legen Sie die untere Klinge der Schere in den Einschnitt und schnitt den Mantel parallel zu der Richtung des Sehnervs, Achten Sie darauf, das Gefäßsystem mit seitlichen Schnitten beschädigt. Verwenden Sie die Pinzette und Schere, um die Dura zu beiden Seiten des Sehnervs zu drapieren.
- Die einzige verbleibende Abdeckung der Nerv ist der Arachnoidea. Es ist sehr dünn und transparent. Um festzustellen, ob die Membran noch vorhanden ist, mit scharfen Zangen an der Oberfläche der Nervenzellen zu kneifen. Es ist die Arachnoidea vorhanden ist, kneifen die Membran und ziehen Sie nach oben, um ein dreieckiger Keil von Gewebe zu schaffen. Machen Sie einen kleinen Schnitt mit der Spitze der Schere ähnlich zu 4,4 Schritt. Dann legen Sie die untere Klinge der Schere und einen Längsschnitt in der Arachnoidea. Als Nächstes verwenden Sie Ihre Scheren und Zangen, um die Arachnoidea an beiden Seiten des Sehnervs zu drapieren.
- Mit einem Mikro-surgische Haken, heben den Sehnerv aus der meningealen Scheide. Pass die Spitze des Hakens um den äußeren Rand des Nerven und stellen Sie sicher, dass der Haken in Kontakt mit den Nerven bleibt, so dass Sie nicht fangen die Meningen mit dem Haken und versehentlich Transekt sie. Heben Sie den Sehnerv aus der meningealen Mantel und vollständig Transekt den Nerv hinter dem Punkt, von dem Haken unterstützt. Die Durchtrennung des Sehnervs Stumpf wird nun ein freies Ende, so dass für das Entfernen des Hakens.
- Wenn die RGCs gehen, um retrograd markiert werden, um das Überleben zu quantifizieren, setzen Sie ein kleines Stück Gelschaum in 3% Fluorogold eingeweicht (oder eine andere retrograde Tracer) über den Sehnerv durchtrennt Stumpf (siehe JoVE Protokoll 2261 ).
5. Closing-und Recovery
- Entlasten Sie die Traktion auf den zusätzlichen Augenmuskeln und Rückkehr des Auges in eine neutrale Position. Während dabei sicher, dass die Gelschaum nach unten drücken, in die Augenhöhle, um sicherzustellen, dass das Auge wieder an seinen Platz gedreht wird, die Gelschaum um den Sehnerv Stumpf bleibt. Bringen Sie die Tränendrüse und extra Augenmuskeln, ihre natürliche Stellung.
- Bringen Sie die Hautlappen an der Mittellinie und Naht der Wunde. Apply Augen Augensalbe in beide Augen. Dann schalten Sie die Isofluran-Quelle und damit das Tier atmen Sauerstoff für einige Minuten. Legen Sie das Tier in einem beheizten Käfig oder einem Käfig unter einer Wärmelampe zu erholen. Stellen Sie keine Betten im Aufwachraum Käfig um die Chance Absaugen Betten während der Wiederherstellung auszuschließen.
- Die Tiere sollten unabhängig nach der Operation untergebracht werden. Postoperativen Analgetika sollten nach den Richtlinien der Tierpflege Behörden verwaltet werden, und Tiere sollten sorgfältig nach der Operation überwacht werden.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Durchtrennung des Sehnervs führt zum Verlust von 90% der Verletzten RGCs innerhalb von 14 Tagen postaxotomy 9-11. Der wichtigste Mechanismus der RGC Tod Apoptose 9, 12. Die normale Dichte von RGCs liegt bei etwa 2500 Zellen / mm 2. Epifluoreszenz oder konfokale Bildgebung lassen sich retrograd markierten RGCs nach Axotomie zu visualisieren. RGC Apoptose wird von ca. 4 Tage nach Axotomie verzögert, so dass ein Zeitfenster für experimentelle Manipulationen. An 1 Tag nach Axotomie und retrograde Markierung mit Fluorogold sind RGC Zellkörper in den Ganglienzellen der Netzhaut und Axon Faszikel in der Nervenfaserschicht der Netzhaut deutlich sichtbar, wenn Abbilden einer flatmounted Vorbereitung (Abb. 1a). Mit 14 Tagen nach Axotomie, hat die Mehrheit der RGCs starb, und ein paar verbliebenen RGCs zwischen retinalen Mikroglia (Abb. 1b) durchsetzt. Wenn RGCs Apoptose, Mikroglia phagozytieren die toten Zellen und als Folge werden transzellulär mit dem fluoreszierenden Tracer, mit denen die RGCs 13, 14 Label gekennzeichnet. Das Aussehen der Tracer in den Phagosomen von Mikroglia unterscheidet sich von dem in überlebenden RGCs. Mikrogliazellen enthalten die Tracer in hochkonzentrierter und extrem helle Phagosomen, die relativ groß und verstreut ihre Zytoplasma (Abb. 1c). RGCs haben eine mehr diffuse Muster der Färbung (Abb. 1c) mit kleinen punktförmigen Vesikel, die retrograd haben ihre Axone transportiert Einreichung Zytoplasma der Zelle. Diese Vesikel sind viel kleiner und haben weniger intensive Fluoreszenz so dass man zum Überleben RGCs von Mikroglia unterscheiden. Darüber hinaus haben Mikroglia viel kleinere Zellkörper und neigen dazu, sternförmig oder amöboide Morphologie zu RGCs, dass relativ große und abgerundete Zellkörper widersetzt haben. Die dendritischen Bäume RGCs kann auch helfen, unterscheiden sie von den kurzen hellen Prozesse der Mikroglia bei der Quantifizierung Überleben der Zelle. Das Überleben der Zelle kann in verschiedenen Regionen der Netzhaut quantifiziert werden und die Dichte (Zellen / mm 2) kann aus dem Bereich der entsprechenden Aufnahmen extrapoliert werden, da RGCs in einer Monoschicht in den Ganglienzellen zu finden sind.
Abbildung 1. Epifluoreszenz Aufnahmen von Fluorogold gekennzeichnet RGCs nach Axotomie und Anwendung der Tracer an den Sehnerv Stumpf. (A) 1 Tag nach Axotomie RGCs und deren Axon Faszikel mit der Tracer in einer feinen punktförmigen Weise gekennzeichnet. (B) Mit dem 14 Tage nach Axotomie, haben 90% der RGCs starb und hell markierte Mikroglia phagozytiert toten Zellen sind ebenfalls mit dem Tracer markiert haben. (C) Höhere Vergrößerung illustriert den Unterschied zwischen RGCs und Mikroglia (rote Pfeile) bei 14 Tagen postaxotomy. Balken in A und B ist 50 pm. Maßstabsbalken in C ist 25 um.
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Discussion
Es gibt viele Variationen dieses chirurgischen Eingriffs und einige der Schritte in diesem Protokoll sind nicht erforderlich. Es ist nur notwendig, um die Muskeln, die den Sehnerv überlagern, um Zugriff auf die Nerven zu gewinnen zurückzuziehen. Allerdings, so resultiert dies in einer sehr begrenzten Arbeitsraum um den Nerv der kritischen Endphase der Durchtrennung erschwert. In bestimmten Situationen ist es wünschenswert, dass die Zellen des Sehnervs Stumpf und den erhöhten Zugang Raum durch Zurückziehen aller Augenmuskeln und der Tränendrüse von Vorteil ist in diesem Fall gewährt transfizieren.
Die wichtigsten Schritte in dem Protokoll sind die Schritte 4,3-4,6. Es ist wichtig, nicht zu den Gefäßen um den Sehnerv beschädigt werden kann. Der Nerv sollte 1,5-2,0 mm von der Rückseite des Auges durchtrennt werden, um Schäden an der Arteria ophthalmica, die den Nerv dringt innerhalb eines Millimeters des Auges und speist Blut in die inneren Netzhaut zu vermeiden. So können durch die Aufrechterhaltung einer kleinen Arbeitsgruppe Abstand von der Rückseite des Auges Schäden an der Arteria ophthalmica vermieden werden. Die Netzhaut ist in der Regel transparent und Blutgefäße können klar abgegrenzt werden. Wenn die Blutversorgung der Netzhaut beschädigt ist die Netzhaut degenerieren, was zu einer milchig-weißen flockigen Aussehen. Der Glaskörper des Auges und der Linse wird in der Regel Wolke über als auch mit dem Auge kleiner, im Laufe der Zeit.
Mit etwas Übung können Sie alle Schritte in der vollen chirurgischen Eingriff in 10-15 Minuten pro Auge durchgeführt werden, sobald die ersten Eintrag Kürzungen vorgenommen wurden. Das Verfahren kann auch aus einer seitlichen Ansatz, um die Umlaufbahn erreicht werden und entweder Route ist sehr gut für Verfahrensänderungen auf die Präferenzen der Forscher basieren. Dieses Modell verfügt über eine hohe Reproduzierbarkeit der zeitliche Verlauf des Zelltods und es gibt mehrere Möglichkeiten, um die Netzhaut global Ziel oder direkt Target verletzt RGCs, um die Effekte der experimentellen Behandlung auf das Überleben der Zelle zu testen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
PDK wird durch eine CIHR Betriebskostenzuschuss (MOP 86523) unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic Frame | Stoelting Co. | ||
| Rat Gas Mask | Stoelting Co. | ||
| Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Isoflurane (PrAErrane) | Baxter Internationl Inc. | DIN 02225875 | |
| Surgical Microscope | WPI, Zeiss, Leica | ||
| Fluorogold -(Hydroxystilbamidine bis(methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| Gelfoam | Pharmacia Corporation (Pfizer) | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | ||
| Proviodine | Medline Industries | MDS093945H | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Fine tip Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Micro surgical hook | Fine Science Tools | 10062-12 | |
| Eye dressing serrated forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #7b sharp curved serrated forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 |
References
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