Summary
Transecção do nervo óptico é um modelo amplamente utilizado de lesão do SNC adulto. Noventa por cento das células ganglionares da retina (RGCs) cujos axônios são completamente seccionado (axotomia) morrem dentro de 14 dias após a axotomia. Esse modelo se adequa facilmente a manipulações experimentais e altamente reprodutível.
Abstract
Células ganglionares da retina (RGCs) são neurônios do SNC que a informação de saída visual da retina para o cérebro, através do nervo óptico. O nervo óptico pode ser acessado dentro da órbita do olho e completamente seccionado (axotomized), cortando os axônios de toda a população RGC. Transecção do nervo óptico é um modelo reprodutível de morte celular por apoptose neuronal no SNC adulto 1-4. Este modelo é particularmente atraente porque a câmara vítrea do olho funciona como uma cápsula para entrega de drogas para a retina, permitindo manipulações experimentais através de injeções intra-ocular. A difusão de substâncias químicas através do fluido vítreo garante que eles agem sobre toda a população RGC. Além disso, RGCs pode ser seletivamente transfectadas através da aplicação de curto RNAs de interferência (siRNAs), plasmídeos ou vetores virais para o fim do corte do nervo óptico vetores 5-7 ou injetar seu alvo, o colículo superior 8. Isso permite que os pesquisadores a estudar mecanismos apoptóticos na população neuronal desejado sem efeitos de confusão sobre os neurônios ou células gliais bystander outras circunvizinhas. Um benefício adicional é a facilidade e precisão com que a sobrevivência da célula podem ser quantificados após a lesão. A retina é um tecido, liso em camadas e RGCs estão localizadas na camada mais interna, a camada de células ganglionares. A sobrevivência da RGCs pode ser rastreado ao longo do tempo através da aplicação de um marcador fluorescente (3% Fluorogold) até o fim do corte do nervo óptico no momento da axotomia, ou pela injeção de traçador no colículo superior (alvo RGC) uma semana antes axotomia. O marcador é transportado retrogradamente, rotulagem toda a população RGC. Porque a camada de células ganglionares é uma monocamada (uma célula de espessura), as densidades RGC podem ser quantificados em tecido liso-montada, sem a necessidade de estereologia. Transecção do nervo óptico leva à morte apoptótica de 90% da RGCs feridos dentro de 14 dias postaxotomy 9-11. RGC apoptose tem uma característica de tempo-curso em que a morte da célula é retardado postaxotomy 3-4 dias, após o qual as células degeneram rapidamente. Isso proporciona uma janela de tempo para manipulações experimentais contra vias envolvidas na apoptose.
Protocol
1. Técnica Cirúrgica
- Experimentos devem ser realizados com técnica asséptica e seguindo os protocolos de uso de animais de sua instituição específica. Instrumentos e materiais (soluções, as substâncias, marcadores, agulhas, etc) entrem em contacto com tecidos vivos, deve ser esterilizado para evitar infecções e impactos negativos no bem-estar animal e os potenciais impactos negativos sobre o estudo.
2. Anestesia
- Ratos serão anestesiados utilizando um sistema vaporizador veterinária isoflurano. Uso de oxigênio classe médica a uma taxa de 0,8 L / min para vaporizar o gás isoflurano. Colocar o animal na caixa de anestesia em anexo e marcar em uma concentração de isoflurano de 4%, até a respiração desacelerou e se o animal está tranqüilo.
- Em seguida, mudar o fluxo de gás para o anexo máscara de gás para o quadro estereotáxico e colocar o animal no aparelho estereotáxico. Por sua vez a concentração de isoflurano para 2% e monitorar anestesia. Animais de maior porte (> 300g) pode exigir uma maior concentração de isoflurano. A anestesia deve ser monitorizada durante a cirurgia e dosagem isoflurano ajustado em conformidade. Profundidade e taxa de respiração deve ser constantemente avaliados e avaliação toe pitada (a cada 5 minutos) para a ausência de dor profunda deve ser realizada.
- Uma vez que a cirurgia está completa, desligue o isoflurano e permitir que o animal ao oxigênio da respiração por vários minutos antes da remoção do dispositivo estereotáxico. Temperatura corporal deve ser mantida, cobrindo o animal com um cobertor cirúrgica e / ou usar um cobertor de aquecimento regulados durante a cirurgia.
3. Abordagem cirúrgica
- Molhar o pêlo no alto da cabeça com etanol 70% para tornar a pele mais fácil de cortar. Retire a pele de entre os olhos usando um cortador ou tesoura afiada. Limpar a área da incisão três vezes, com aplicações alternadas de solução de detergente de iodo (Betadine Proviodine, etc), seguido pelo etanol 70%. Manter a córnea úmida durante toda a cirurgia através da aplicação de pomada oftálmica nos olhos (lágrimas Naturale PM) para a córnea. Espalhar a pomada sobre a superfície da córnea por manualmente abrindo e fechando as pálpebras.
- Usando uma lâmina n º 11, fazer uma incisão ao longo da linha média da cabeça de aproximadamente 0,5 cm à frente dos olhos a 1 cm atrás dos olhos. Recolher o flap de pele sobre o olho com a pinça e gentilmente provocar afastado o tecido conjuntivo subjacente com a parte de trás do bisturi. Então, recolher o flap de pele lateralmente e para baixo e segure no lugar com um retrator cirúrgico que pode ser colado na base do aparelho estereotáxico.
- Faça uma incisão ao longo da borda superior do osso orbital, enquanto puxando a fáscia que cobre com uma pinça afiada. Isso vai retirar a fáscia que recobre a órbita do olho. A borda do osso orbital pode ser claramente demarcada usando uma pinça para empurrar para baixo sobre a fáscia que recobre a órbita. Usando um cautério ou bisturi, continue a incisão para trás para o limite posterior da órbita do olho. Use o osso da órbita superior como um guia para a incisão. Em seguida continue a frente da incisão para o limite anterior da órbita. A incisão da órbita superior é o melhor feito usando um cautério pequenos, a fim de evitar sangramento dos vasos subjacentes que se comunicam com os seios venosos.
- Se o sangramento ocorre várias etapas podem ser tomadas. Em primeiro lugar, aplicar pressão usando swabs estéreis cirúrgica ou cotonetes. Se o sangramento continua, aplicar frio, solução salina tampão estéril de fosfato (PBS) para a área usando um conta-gotas, e manter a pressão. Sangramento menor vai parar depois de alguns segundos usando este procedimento. Se o sangramento persistir, aplique a tração para o tecido com o cotonete cirúrgico ou cotonete, a fim de identificar a origem da hemorragia e rapidamente cauterizar o vaso comprometido. Depois que o sangramento é contido, use frio PBS esterilizado para limpar a área cirúrgica do sangue. A área cirúrgica devem ser periodicamente limpos desta forma, a fim de visualizar melhor as estruturas na órbita do olho.
- Uma vez que a incisão tenha sido limpo, utilize uma pinça e parte de trás do bisturi para limpar o tecido conjuntivo na parte de trás do olho que recobre o conteúdo orbital. Parte de trás do bisturi n º 11 funciona bem como a ponta é fina. Isto irá abrir porções mais profundas da cavidade orbital proporcionando uma maior janela cirúrgica para trabalhar dentro Use Dumont 7b # sharp-curvo-serrilhada forceps durante o trabalho no olho como a sua curvatura e dicas finas são ideais para a manipulação de estruturas em órbita. Além disso, o serrilhas ajudar com estruturas de fixação.
- Em seguida, retire o tecido conjuntivo que envolve a divisão oftálmica do nervo trigêmeo, que fica perto da linha média, e remover o nervo usando uma pinça. Este passo não é necessário, no entanto remover o nervo irá proporcionar uma maior janela de access para o nervo óptico mais tarde.
- Após a remoção do nervo, utilize uma pinça para retirar o vaso sanguíneo abaixo e completamente cauterizar o vaso. Esta etapa também não é necessário, no entanto cautério da embarcação permite que ele seja transferido anteriormente, criando assim uma janela maior uma vez que o nervo óptico é atingido.
- Use um par de pinças afiadas, ou fórceps que tiveram suas pontas dobradas para dentro, para escolher com cuidado e retire a fina camada de tecido conjuntivo ao longo dos músculos extra-oculares e glândula lacrimal. Retrair os músculos oculares extra a partir de anterior para posterior da órbita. Segure a parte proximal do músculo com uma pinça e usar um segundo par de pinças curvas serrilhadas vestir olho para aplicar tração externa sobre o músculo. Certifique-se que a pinça de vestir os olhos são orientadas na mesma direção como o músculo ao puxar para evitar rasgamento. Retire o músculo mais anterior da órbita (Superior Oblique) dessa maneira. O músculo será liberado de dentro da órbita eo comprimento restante pode ser retraído, a fim de girar o olho para fora.
- Repita o Passo 3,8 com o músculo seguinte (reto medial) que está localizado entre os lobos da glândula lacrimal e Gland Harderian perto da linha média da superfície dorsal do olho. Tape as retrator para manter a tração sobre os músculos.
- Remova com cuidado o tecido remanescente conjuntivo sobre a superfície da glândula lacrimal e levante a glândula para cima usando uma pinça. Não comprimir ou apertar as glândulas. , A fim de retirar a glândula, apenas um único navio no pólo posterior precisa ser cauterizado. Levante a extremidade posterior da glândula para cima, e depois cauterizar o vaso.
- Em seguida, flap da glândula lacrimal para a frente para abrir a parte posterior da órbita e permitir livre acesso para os músculos que recobrem o nervo óptico. Manter a área sempre úmida usando PBS estéril e secagem com compressas cirúrgicas ou cotonetes.
- Utilizando uma pinça afiada, mais uma vez remover o tecido fino conectivo que envolve os músculos da órbita posterior (levantador da pálpebra superior e reto superior) e separar os feixes de músculos subjacentes. Retrair os músculos de forma independente ou em conjunto, utilizando a curva serrilhada forceps vestir olho, mais uma vez, puxando em linha com as fibras musculares. Anexar os comprimentos musculares restantes para o afastador juntamente com os músculos que foram recolhidos nas Etapas 3.8 e 3.9 e fita para baixo o retrator para aplicar tração. Um total de 4 músculos agora será anexado ao retrator. Isso irá girar o olho para a frente e para fora, a fim de revelar a capa de gordura que contêm que envolve o nervo óptico.
4. Acessando o Nervo Óptico
- Use uma pinça afiada (Fine ponta Dumont) para puxar para cima sobre o tecido conjuntivo que envolve a bainha de gordura do nervo óptico. Faça um corte longitudinal com uma tesoura pequena mola Vannas. Expandir o corte como necessário. A gordura contida pela bainha começará a protuberância para fora uma vez que o corte é feito. Em seguida retire os retalhos de tecido conjuntivo com cuidado puxando para cima a partir da borda e cortar as abas em forma de crescente de tecido.
- Remova a gordura que cobre o nervo óptico, usando uma pinça para puxar a gordura, enquanto o corte com a tesoura primavera Vannas. Manter a área limpa usando PBS esterilizado e compressas cirúrgicas para limpar a pequenas quantidades de sangue que surgem a partir da remoção do tecido.
- O nervo óptico é agora visível. Para acessar o nervo, a bainha meníngea que envolve o nervo deve ser removido sem danificar a artéria oftálmica que alimenta a retina interna. Examine o padrão vascular da bainha meníngea usando uma pinça para girar suavemente a bainha. Procure uma área desprovida de vasos sanguíneos, e permitindo um corte longitudinal a ser feita na bainha meníngea.
- Usando a ponta fina Dumont fórceps, beliscar a dura e puxar para cima. Perto da base da cunha triangular em forma de dura que é criado, use a tesoura primavera Vannas para fazer uma pequena incisão na bainha. Insira o menor lâmina da tesoura na incisão e cortar a bainha paralela à direção do nervo óptico, cuidado para não danificar os vasos com cortes laterais. Use a pinça e tesouras para armar a dura para ambos os lados do nervo óptico.
- O revestimento único remanescente do nervo é a membrana aracnóide. É muito fina e transparente. A fim de determinar se a membrana está ainda presente, utilize uma pinça afiada para beliscar a superfície do nervo. É a aracnóide está presente, apertar a membrana e puxe para cima para criar uma cunha triangular de tecido. Fazer uma pequena incisão com a ponta da tesoura semelhante ao Passo 4.4. Em seguida, insira a parte inferior da lâmina da tesoura e fazer um corte longitudinal na aracnóide. Em seguida, use a sua tesoura e uma pinça para armar a aracnóide para ambos os lados do nervo óptico.
- Usando um micro-surgancho tecnológico, elevar o nervo óptico para fora da bainha meníngea. Passe a ponta do anzol em torno da borda externa do nervo e certifique-se que o gancho fica em contato com o nervo, para que você não pegar as membranas das meninges com o gancho e acidentalmente transecto-los. Levante cuidadosamente o nervo óptico para fora da bainha meníngea e completamente transecto o nervo atrás do ponto apoiado pelo gancho. O coto do nervo óptico transeccionados terá agora uma extremidade livre, permitindo a remoção do gancho.
- Se o RGCs vão ser retrogradamente marcados, a fim de quantificar a sobrevivência, coloque um pequeno pedaço de gelfoam embebido em Fluorogold 3% (ou outra tracer retrógrada) sobre o coto do nervo seccionado óptica (ver JOVE protocolo de 2261 ).
5. Fechamento e recuperação
- Aliviar a tração sobre os músculos oculares extras e voltar os olhos para uma posição neutra. Ao fazê-lo, certifique-se para empurrar o gelfoam para dentro da órbita do olho para garantir que a vista é girada de volta no lugar, o gelfoam permanece em torno do coto do nervo óptico. Retorno da glândula lacrimal e músculos oculares extra para suas posições naturais.
- Devolver o retalho de pele para a linha média e sutura do ferimento. Aplicar pomada oftálmica para ambos os olhos. Então, desligue a fonte de isoflurano e permitir que o animal ao oxigênio da respiração por vários minutos. Colocar o animal em uma gaiola aquecida ou uma gaiola debaixo de uma lâmpada de calor para se recuperar. Não coloque nenhum fundamento na gaiola de recuperação para eliminar a possibilidade de aspiração da cama durante a recuperação.
- Animais devem ser alojados de forma independente após a cirurgia. Pós-cirúrgica analgésicos devem ser administrados de acordo com as diretrizes de sua autoridades cuidados com os animais e os animais devem ser cuidadosamente monitorizados após a cirurgia.
6. Resultados representativos:
Transecção do nervo óptico resultados na perda de 90% dos RGCs feridos dentro de 14 dias postaxotomy 9-11. O principal mecanismo da morte RGC é apoptose 9, 12. A densidade normal de RGCs é de aproximadamente 2.500 células / mm 2. Imagens de epifluorescência ou confocal pode ser usado para visualizar RGCs retrogradamente marcados após axotomia. Apoptose RGC é adiada por aproximadamente 4 dias após axotomia, deixando uma janela de tempo para manipulações experimentais. Menos 1 dia após a axotomia e rotulagem retrógrada com Fluorogold, corpos celulares RGC na camada de células ganglionares da retina e fascículos axônio na camada de fibras nervosas da retina são claramente visíveis quando a imagem de um preparo flatmounted (Fig 1a). Por 14 dias após a axotomia, a maioria dos RGCs morreram, e um RGCs poucos remanescentes são intercaladas entre microglia da retina (Fig 1b). Quando RGCs sofrem apoptose, microglia fagocitam as células mortas e, como resultado tornar transcellularly rotulado com o marcador fluorescente que era usado para rotular a RGCs 13, 14. A aparência do marcador no fagossomos de microglia é diferente daquela em RGCs sobreviventes. Microglia conter o marcador nos fagossomos altamente concentrada e extremamente luminosos, que são relativamente grandes e espalhados por todo o seu citoplasma (Fig. 1c). RGCs têm um padrão mais difuso de coloração (Fig. 1c) com pequenas vesículas puntiformes que foram transportados retrogradamente para baixo seus axônios apresentação do citoplasma da célula. Essas vesículas são muito menores e têm menos intensa fluorescência permitindo que se possa diferenciar RGCs sobrevivente da microglia. Além disso, microglia têm corpos celulares muito menores e tendem a ter uma morfologia estreladas ou amoeboid ao contrário RGCs que têm corpos celulares relativamente grandes e arredondadas. As árvores dendríticas de RGCs também pode ajudar a diferenciá-los dos processos curto brilhante da microglia, ao quantificar a sobrevivência da célula. Sobrevivência da célula podem ser quantificados em diferentes regiões da retina e da densidade (células / mm 2) podem ser extrapolados a partir da área do micrografias correspondentes, desde RGCs são encontrados em uma monocamada dentro da camada de células ganglionares.
Figura 1. Micrografias de epifluorescência de Fluorogold RGCs rotulados após axotomia e aplicação do traçador ao coto do nervo óptico. (A) um dia após axotomia RGCs fascículos e seu axônio são rotulados com o marcador de uma forma bem pontuada. (B) Por 14 dias após a axotomia, 90% dos RGCs morreram e brilhantemente rotulados microglia que fagocitados células mortas também são rotulados com o marcador. (C) Maior aumento ilustrando a diferença entre RGCs e microglia (setas vermelhas) em 14 postaxotomy dias. Barra de escala em A e B é 50 mm. Barra de escala em C é 25 mm.
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Discussion
Há muitas variações deste procedimento cirúrgico e vários dos passos neste protocolo não são necessárias. Só é necessário para retrair os músculos que recobrem o nervo óptico, a fim de ganhar acesso ao nervo. No entanto, isso resulta em um espaço muito limitado trabalhando ao redor do nervo fazendo os estágios críticos final da transecção mais difícil. Em certas situações é desejável transfecção as células do tronco do nervo óptico e do espaço maior acesso proporcionada pela retração de todos os músculos extra-oculares e glândula lacrimal é benéfico neste caso.
As etapas mais críticas no protocolo são etapas 4,3-4,6. É importante para não danificar os vasos ao redor da cabeça do nervo óptico. O nervo deve ser seccionado 1,5-2,0 mm do fundo do olho, a fim de evitar qualquer dano à artéria oftálmica que penetra o nervo dentro de um milímetro do olho e alimenta do sangue para a retina interna. Assim, mantendo uma pequena distância de trabalho da parte de trás do olho danos à artéria oftálmica pode ser evitado. A retina é normalmente transparente e vasos sanguíneos pode ser claramente demarcada. Se o suprimento de sangue da retina é danificada da retina vão se degenerar conduzindo a um aspecto floculantes branco leitoso. A câmara de vítreo do olho ea lente normalmente nuvem sobre, bem como, com o olho encolhendo de tamanho ao longo do tempo.
Com a prática, todas as etapas do procedimento cirúrgico completo pode ser realizado em 10-15 minutos por olho, uma vez que os cortes de entrada inicial ter sido feita. O procedimento também pode ser realizado a partir de uma abordagem lateral da órbita e uma rota é altamente passível de modificações processuais com base nas preferências do pesquisador. Este modelo tem um curso de tempo altamente reprodutível de morte celular e existem várias maneiras para atingir a retina globalmente ou diretamente alvo RGCs feridos a fim de testar os efeitos dos tratamentos experimentais sobre a sobrevivência da célula.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
PDK é suportado por uma operação CIHR subvenção (MOP 86,523)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic Frame | Stoelting Co. | ||
| Rat Gas Mask | Stoelting Co. | ||
| Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Isoflurane (PrAErrane) | Baxter Internationl Inc. | DIN 02225875 | |
| Surgical Microscope | WPI, Zeiss, Leica | ||
| Fluorogold -(Hydroxystilbamidine bis(methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| Gelfoam | Pharmacia Corporation (Pfizer) | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | ||
| Proviodine | Medline Industries | MDS093945H | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Fine tip Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Micro surgical hook | Fine Science Tools | 10062-12 | |
| Eye dressing serrated forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #7b sharp curved serrated forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 |
References
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