Summary
Optik Sinir transeksiyonu yetişkin MSS yaralanma yaygın olarak kullanılan bir model. Retina ganglion hücrelerinin yüzde doksanı (RGCs) olan aksonlar tamamen axotomy sonra 14 gün içinde ölürler (axotomy) transeksiyon. Bu model, deneysel manipülasyonlar kolayca mükellef ve yüksek tekrarlanabilir.
Abstract
Retina ganglion hücrelerinin (RGCs) MSS nöronlar olduğunu retina optik sinir yoluyla beyne görsel bilgi çıktı. Optik sinir göz yörüngesinin içinde erişilebilir ve tüm RGC nüfus aksonlar tamamen kesme, (axotomized) transeksiyon olabilir. Optik sinir transeksiyonu yetişkin MSS 1-4 apoptotik nöron hücre ölümü tekrarlanabilir bir model. Bu model özellikle çekici, göz vitreus kamara göz içi enjeksiyonları ile deneysel manipülasyonlar izin retina ilaç dağıtım için bir kapsül gibi davranır çünkü. Vitreus sıvı ile kimyasal difüzyon tüm RGC nüfus üzerine hareket etmelerini sağlar. Ayrıca, RGCs seçici hedef, üstün colliculus 8 içine optik sinir 5-7 veya enjekte vektörler kesme sonuna kadar kısa müdahale RNA'lar (siRNA), plazmid ya da viral vektörlerin uygulayarak transfekte olabilir. Bu araştırmacılar, diğer seyirci nöron veya glia çevreleyen karıştırıcı etkisi olmadan istenilen nöronal nüfus apoptotik mekanizmalar çalışma sağlar. Ek bir avantaj, kolaylık ve doğruluk hücre sağkalım yaralanma sonrası sayısal olabilir. Retinanın düz, katmanlı bir dokudur ve RGCs en içteki tabaka, ganglion hücre tabakası lokalize. RGCs, hayatta kalma, bir floresan tracer (% 3 Fluorogold), axotomy zaman optik sinir kesme sonuna kadar uygulayarak, ya da İzleyicinin üstün colliculus (RGC hedef) bir hafta önce içine enjekte edilerek zaman içinde takip edilebilir axotomy. Tracer retrograd tüm RGC nüfus etiketleme, taşınır. Ganglion hücre tabakası bir tek tabaka (kalın bir hücre) olduğundan, RGC yoğunlukları stereology için gerek kalmadan düz monte edilmiş doku nicel olabilir. Optik sinir transeksiyonu 14 postaxotomy 9-11 gün içinde% 90 yaralı RGCs apoptotik ölüme yol açar. RGC apoptozis, hücre ölümü hücrelerin hızla dejenere sonra 3-4 gün postaxotomy, gecikmiş sayede ders karakteristik bir zaman vardır. Bu deneysel manipülasyonlar apoptozis dahil yollar yöneltilen bir zaman penceresi sağlar.
Protocol
1. Cerrahi Teknik
- Aseptik teknik kullanılarak deneyler ve özel kurum hayvan kullanımını protokolleri takip yapılmalıdır. Canlı doku ile temas eden alet ve malzemeler (çözümleri, test maddeler, izleyiciler, iğne, vb), hayvan refahı ve çalışma üzerindeki olası olumsuz etkileri üzerinde enfeksiyon ve olumsuz etkilerini önlemek için steril olmalıdır.
2. Anestezi
- Sıçanlar bir veteriner izofluran buharlaştırıcı sistemi kullanılarak anestezi olacaktır. Isofluran gaz buharlaştırmak için 0.8 L / dak hızında tıbbi sınıf oksijen kullanın. Ekli anestezi kutusunda hayvan koyun ve nefes yavaşladı ve hayvan oturaklı kadar izofluran konsantrasyonu% 4 çevirmeli.
- Sonra, stereotaksik çerçeve için gaz maskesi ek gaz akışını değiştirmek ve stereotaksik aparat hayvan. Izofluran konsantrasyonu% 2 aşağı çevirin ve anestezi monitör. Büyük hayvanların (> 300g) yüksek konsantrasyonda izofluran bir gerektirebilir. Anestezi, ameliyat sırasında takip ve izofluran dozu buna göre ayarlanması gerekir. Derinlik ve nefes alma oranı sürekli olarak değerlendirilir ve derin bir ağrı olmaması için ayak tutam değerlendirme (her 5 dakikada bir) yapılmalıdır.
- Ameliyat tamamlandıktan sonra, izofluran kapatın ve hayvan stereotaksik cihazdan çıkarılması önce birkaç dakika nefes oksijen izin. Vücut ısısı, cerrahi battaniye ve / hayvan kapsayan ya da operasyon sırasında düzenli bir ısıtma battaniye kullanarak sağlanmalıdır.
3. Cerrahi Yaklaşım
- Kürk kürk kesmek kolay hale getirmek için% 70 etanol ile baş üstünde ıslak. Clipper ya da keskin bir makas kullanarak gözler arasında kürk çıkarın. Iyot deterjan solüsyonu,% 70 etanol alternatif uygulamaları (Proviodine, Betadine, vb) ile kesi alan üç kez temizleyin. Kornea kornea oftalmik göz merhemi (Tears Naturale PM) uygulanarak ameliyat boyunca nemli koruyun. , Kornea, göz kapaklarında el açılış ve kapanış yüzeyi üzerinde merhem sürün.
- No: 11 bıçak kullanarak, gözlerinin arkasında 1 cm gözleri önünde yaklaşık 0,5 cm baş orta hat boyunca bir kesi yapmak. Cilt kapağı forseps kullanarak göz üzerinden çekin ve yavaşça neşter arkasında yatan bağ dokusu uzak kızdırmak. Daha sonra, yanal ve cilt kapağı aşağıya doğru geri çekin ve stereotaksik enstrümanın temel bantlanmış olabilir cerrahi retraktörü ile yerinde tutun.
- Keskin forseps ile örten fasya çekerken orbital kemik üstün kenarı boyunca bir kesi olun. Bu göz yörünge üzerinde fasya çekilecek. Orbital kemik jant açıkça forseps kullanarak yörünge üzerinde fascia aşağı itmek tarafından sınırları çizilmiş olabilir. Koter cihazı veya bisturi kullanarak, göz yörüngesine arka sınıra geri kesi devam etmektedir. Kesi için bir rehber olarak üstün yörüngesinin kemik kullanın. Sonraki yörüngesinin anterior sınırı kesi ileriye doğru devam edin. En üstün yörüngesinin insizyon venöz sinüsler ile iletişim altta yatan damarlarında kanama önlemek için küçük bir koter cihazı kullanılarak yapılır.
- Kanama olursa birkaç adım alınabilir. Birincisi, steril cerrahi çubuklar veya pamuklu çubuk kullanarak basınç uygulayın. Kanama devam ederse, soğuk, steril fosfat buffer salin (PBS), bir damlalık kullanarak alana uygulamak ve basınç korumak. Bu yordamı kullanarak birkaç saniye sonra ufak bir kanama duracaktır. Kanama devam ederse, kanama kaynağını belirlemek ve hızlı bir şekilde tehlikeye gemi dağlamak için cerrahi bir bez ya da pamuklu dokusu çekiş geçerlidir. Kanama içerdiği sonra, kan cerrahi alanını temizlemek için soğuk steril PBS kullanın. Cerrahi alan, periyodik olarak yapıları göz yörüngede daha iyi görselleştirmek için bu moda temizlenmesi gerekir.
- Kesi temizlendikten sonra, yörünge içeriği üzerine, gözün arka bağ dokuları temizlemek için forseps ve neşter arka kullanın. No: 11 neşter arka ucu ince olduğu gibi iyi çalışır. Bu yörünge boşluğuna yörüngede yapıların güçlendirilmesi için idealdir, eğrilik ve ince ipuçları gibi göz çalışırken kullanın Dumont # 7b keskin kavisli-dişli forseps çalışmak için daha büyük bir cerrahi bir pencere daha derin kısımları açılacaktır. Ayrıca, çentikler sürükleyici yapıları ile yardımcı olur.
- Sonra, orta hatta yakın oturan trigeminal sinirin oftalmik bölümünü çevreleyen bağ dokusu kaldırmak ve forseps kullanarak sinir kaldırmak. Bu adım gerekli değildir, ancak sinir kaldırarak acces daha büyük bir pencere sağlayacakDaha sonra optik sinir s.
- Sinir çıkarıldıktan sonra, aşağıda kan damarı geri çekmek için forseps kullanabilir ve gemi tamamen dağlamak. Bu adım da gerekli değildir, ancak geminin koter ve böylece daha büyük bir pencere oluşturarak optik sinir ulaşıldığında, öne taşınmasına neden olur.
- Ipuçları, ekstraoküler kasların ve gözyaşı bezi üzerinde dikkatle bağ dokusunun ince bir tabaka almak ve kaldırmak için içe eğilmişti keskin forseps çifti, ya da forseps kullanın. Yörüngesinin posterior anterior ekstra oküler kasların geri çekin. Forseps bir çift kas proksimalinde Grip ve kas dışa çekiş uygulamak için ikinci bir çifti, eğimli dişli göz soyunma forseps kullanabilir. Yırtılmasını önlemek amacıyla çekerken göz soyunma forseps kas aynı yönde odaklı olduğunu emin olun. Bu şekilde yörüngede (Superior Eğik) en anterior kas çıkarın. Kas yörünge içinde derin kurtarılmış olacak ve kalan uzunluğu gözün dışa döndürmek için geri çekilebilir.
- Göz dorsal yüzeyinin orta hat yakınında lakrimal bez ve Harderian Bezi loblar arasında yer alan bir sonraki kas (medial Rektus) Adım 3.8 tekrarlayın. Teyp retraktörü aşağı çekiş kaslar üzerine korumak için.
- Lakrimal bez yüzeyi üzerinde kalan herhangi bir bağ dokusu yavaşça kaldırın ve forseps kullanarak bezi yukarı kaldırın. Bezinin sıkıştırmak veya sıkmak etmeyin. Bezi geri çekmek için sadece tek bir gemi, arka kutupta koterize gerekir. Yukarı bezinin arka ucunu kaldırın ve ardından geminin dağlamak.
- Sonra, yörüngesinin arka kısmı açık ve optik sinir örten kaslar için engelsiz erişime izin vermek için ileri lakrimal bez, flap. Sürekli nemli steril PBS ve cerrahi çubuklar veya pamuklu kurutma tutun.
- Keskin forseps kullanarak arka yörüngede (levator Palpebrae Superioris ve Superior Rektus) kasları çevreleyen ince bir bağ dokusu bir kez daha kaldırmak ve altta yatan kas demetleri ayrı. Kavisli tırtıklı göz soyunma forseps kullanarak, bağımsız olarak veya ağızdan kasları geri çekin, bir kez daha, kas lifleri ile çizgi çekerek. Retraktörü aşağı Adımlar 3.8 ve 3.9 ve teyp çekiş uygulamak için geri çekilir kasları ile birlikte kalan kas uzunlukları retraktörü takın. Toplam 4 kasların retraktörü eklenecektir. Bu optik siniri çevreleyen yağ içeren kılıf ortaya çıkarmak için ileri ve gözün dışa doğru dönecektir.
4. Optik Sinir erişme
- Yağ optik sinir kılıfı çevreleyen bağ dokusu yukarı çekmek için keskin forseps (Güzel ucu Dumont) kullanın. Uzunlamasına kesilmiş küçük Vannas yaylı makas kullanılarak olun. Gerektiği gibi kesme genişletin. Kesim yapıldıktan sonra kılıf içerdiği yağ çıkıntı dışarı başlayacak. Sonra kenarından dikkatlice yukarı çekerek ve hilal şekilli flep dokusu kesilerek bağ doku kapakları kaldırmak.
- Vannas yaylı makas ile kesim yaparken, yağ çekmek için forseps kullanarak yağ örten optik sinir çıkarın. Alan dokusunun çıkarılması kaynaklanan küçük miktarlarda kan temizlemek için steril PBS ve cerrahi swablar kullanarak temiz tutun.
- Optik sinir görülebilir. Sinir erişmek için, sinir çevreleyen meningeal kılıf, iç retinanın besleyen oftalmik arter zarar vermeden çıkarılması gerekir. Yavaşça kılıf döndürmek için forseps kullanarak meningeal kılıf vasküler desenini inceleyin. Bak, kan damarlarının yoksun bir alan ve uzunlamasına kesilmiş izin meningeal kılıf içinde yapılacak.
- Ince uçlu Dumont forseps kullanarak, dura çimdik ve yukarı doğru çekin. Dura oluşturulan üçgen şeklindeki kama üssü yakınlarında, kılıf küçük bir kesi yapmak için Vannas yaylı makas kullanın. Alt bıçak, makas kesi içine yerleştirin ve kılıf, optik sinir, yan keser, damar zarar vermemek için dikkatli yönüne paralel kesmek. Dura optik sinir her iki tarafında asmak için forseps ve makas kullanın.
- Sinir tek kalan kapsayan araknoid membran. Bu çok ince ve şeffaf. Membran hala mevcut olup olmadığını belirlemek amacıyla, sinir yüzeyinde çimdik keskin forseps kullanabilir. Araknoid mevcut membran çimdik ve üçgen kama bir doku oluşturmak için yukarı doğru çekin. 4.4 Adım benzer makas ucu ile küçük bir kesi olun. Sonra alt bıçak, makas yerleştirin ve araknoid uzunlamasına kesin. Sonra, iki tarafında optik sinirin araknoid asmak için makas ve forseps kullanın.
- Bir mikro-surjik kanca, meningeal kılıf optik sinir yükseltirler. Sinirin dış kenarı etrafında Pass ucu kanca ve kanca kanca ile meningeal membranlar yakalamak ve yanlışlıkla transect böylece sinir ile temas halinde kalmasını emin olun. Meningeal kılıf optik sinir yavaşça kaldırın ve kanca tarafından desteklenen noktası arkasında tamamen sinir transeksiyonu. Transeksiyon optik sinir güdük kanca çıkarılması için izin, ücretsiz bir sonu olacaktır.
- RGCs retrograd hayatta kalma ölçmek için etiketlenmesine gidiyoruz, gelfoam transeksiyon optik sinir (bkz. güdük üzerinde (veya başka bir retrograd tracer)% 3 Fluorogold batırılmış küçük bir parça yerleştirmek vallahi protokolü 2261 ).
5. Kapanış ve Kurtarma
- Ekstra oküler kasların çekiş tahliye ve tarafsız bir konumda göz dönmek. Bunu yaparken, geri yerine göz döndürülür gelfoam, optik sinir güdük çevresinde kalmasını sağlamak için göz yörüngesine gelfoam aşağı itmek için emin olun. Lakrimal bez ve ekstra oküler kasların doğal konumlarına geri dön.
- Orta hat cilt kapağı dönün ve yara sütür. Her iki gözü oftalmik göz merhemi sürün. Sonra, izofluran kaynağını kapatın ve birkaç dakika nefes oksijen hayvan izin. Hayvan kurtarmak için bir ısı lambası altında ısıtılmış bir kafes ya da bir kafes yerleştirin. Kurtarma kafes, kurtarma sırasında yataklar aspire şansını ortadan kaldırmak için herhangi bir yataklar koymayın.
- Hayvanlar ameliyattan sonra bağımsız ev sahipliği olmalıdır. Cerrahi sonrası analjezikler, hayvan bakımı makamlarının kurallarına göre uygulanan ve hayvanların ameliyattan sonra dikkatlice izlenmelidir.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
14 gün içinde% 90 yaralı RGCs postaxotomy 9-11 kaybı, optik sinir kesisi. RGC ölüm ana mekanizması apoptozis 9, 12. RGCs normal yoğunluğu yaklaşık 2500 hücre / mm 2. Epifloresans veya konfokal görüntüleme axotomy sonra retrograd etiketli RGCs görselleştirmek için kullanılabilir. RGC apoptozis deneysel manipülasyonlar için bir zaman penceresi bırakarak, axotomy sonra yaklaşık 4 gün gecikti. 1 gün sonra axotomy ve Fluorogold ile retrograd etiketleme, RGC hücre gövdeleri, retina ve retina sinir lifi tabakası akson fasiküller ganglion hücre tabakası açıkça görülebilir görüntüleme flatmounted hazırlama (Şekil 1a). Axotomy 14 gün sonra, RGCs çoğunluğu ölmüş ve kalan birkaç RGCs retina mikroglia (Şekil 1b) arasında serpiştirilmiş. RGCs apoptozis, mikroglia fagosite ölü hücreler ve bir sonucu olarak 13, 14 RGCs etiketlemek için kullanılan floresan izleyici ile etiketlenmiş transcellularly haline geçer. Mikroglia phagosomes tracer görünüm hayatta RGCs farklı. Mikroglia, nispeten büyük ve sitoplazmaya (Şekil 1c) dağılmış son derece konsantre ve son derece parlak phagosomes tracer içerir. RGCs retrograd hücre sitoplazma dosyalama aksonlar taşınmıştır küçük noktalı veziküller ile boyanarak daha yaygın bir deseni (Şekil 1c). Bu veziküller daha küçük ve daha az yoğun floresan bir mikroglia hayatta RGCs ayırt etmek için izin var. Ayrıca, mikroglia, çok daha küçük bir hücre gövdeleri ve nispeten büyük ve yuvarlak hücre gövdeleri RGCs karşı bir stellat veya amoeboid morfolojisi sahip olma eğilimindedir. RGCs dendritik ağaçları da hücre sağkalım nicel, mikroglia kısa parlak süreçlerinden onları ayırt yardımcı olabilir. Hücre sağkalım retinanın farklı bölgelerinde sayısal ve RGCs ganglion hücre tabakası içinde bir tek tabaka bulunur yoğunluğu (hücre / mm 2), ilgili mikrograflar alan ekstrapole olabilir.
Şekil 1, optik sinir güdük tracer axotomy ve uygulama sonrası Fluorogold etiketli RGCs Epifloresans mikrograflar . (A) axotomy RGCs ve akson fasiküller 1 gün sonra, ince bir noktalı şekilde izleyici ile etiketlenir. (B) axotomy sonra 14 gün olarak, ölü hücreleri de izleyici ile etiketlenmiş fagosite mikroglia% 90 RGCs öldü ve parlak etiketli. (C) Yüksek büyütme 14 gün postaxotomy RGCs ve mikroglia (kırmızı ok uçları) arasındaki farkı gösteren. Ölçeği A bar ve B 50 mm. C Ölçek çubuğu 25 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu cerrahi prosedürün çok varyasyon vardır ve bu protokol adımları birkaç gerekli değildir. Sadece sinir erişmek için optik sinir örten kasları geri çekmek için gerekli. Ancak, sinir çevresinde çok sınırlı bir çalışma alanı bu sonuçları kesisi kritik son aşamaya daha zor hale. Bazı durumlarda, optik sinir güdük hücreleri ve tüm ekstraoküler kasları ve lakrimal bezi bu durumda faydalıdır geri çekilmeden sağladığı artan erişim alanı transfect arzu edilir.
Protokolde en kritik adımlar Adımlar 4,3-4,6. Optik sinir başı çevresinde damarsal zarar vermemek için çok önemlidir. Sinir içinde bir milimetre, göz ve beslemeleri kan iç retina sinir nüfuz oftalmik arter herhangi bir zarar gelmesini önlemek amacıyla, gözün arka 1.5-2.0 mm transeksiyon olmalıdır. Böylece, göz hasarı geri oftalmik arterin küçük bir çalışma mesafesi koruyarak önlenebilir. Retinanın normalde şeffaf ve kan damarlarının açık olarak belirli olabilir. Retina retina kan dolaşımı bozuksa, sütlü-beyaz yün görünümü önde gelen dejenere. Genellikle zaman içinde boyut olarak küçülen ile göz göz ve lens vitreus odasının yanı sıra üzerinde bulut olacak.
Uygulama ile, tam bir cerrahi işlem tüm adımların ilk giriş kesintileri yapıldıktan sonra, ortalama 10-15 dakika göz başarılı olabilir. Yörüngesine lateral yaklaşım prosedürü de başarılı ve iki rota araştırmacı tercihlerine göre usul değişiklikler için son derece müsait. Bu modelin hücre ölümü son derece tekrarlanabilir zaman içerisinde ve küresel hedef retina veya doğrudan deneysel tedaviler hücre sağkalım üzerine etkileri test etmek amacıyla yaralı RGCs hedef çeşitli yolları vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
PDK CIHR işletim hibe (MOP 86.523) tarafından desteklenen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic Frame | Stoelting Co. | ||
| Rat Gas Mask | Stoelting Co. | ||
| Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Isoflurane (PrAErrane) | Baxter Internationl Inc. | DIN 02225875 | |
| Surgical Microscope | WPI, Zeiss, Leica | ||
| Fluorogold -(Hydroxystilbamidine bis(methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| Gelfoam | Pharmacia Corporation (Pfizer) | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | ||
| Proviodine | Medline Industries | MDS093945H | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Fine tip Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Micro surgical hook | Fine Science Tools | 10062-12 | |
| Eye dressing serrated forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #7b sharp curved serrated forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 |
References
- Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).
- Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration. Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).
- Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).
- Weishaupt, J. H., Bahr, M. Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system - molecular death and survival pathways. Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).
- Valenzuela, G. arcia, E, S. C. S. harma Rescue of retinal ganglion cells from axotomy-induced apoptosis through TRK oncogene transfer. Neuroreport. 9, 3165-3170 (1998).
- Kugler, S. Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death. Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).
- Lingor, P. Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo. Brain. 128, 550-558 (2005).
- Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125, 903-920 (2004).
- Berkelaar, M. Axotomy results in delayed death and apoptosis of retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci. 14, 4368-4374 (1994).
- Villegas-Perez, M. P. Influences of peripheral nerve grafts on the survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci. 8, 265-280 (1988).
- Villegas-Perez, M. P. Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats. J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).
- Quigley, H. A. Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36, 774-786 (1995).
- Thanos, S. Specific transcellular carbocyanine-labelling of rat retinal microglia during injury-induced neuronal degeneration. Neurosci Lett. 127, 108-1012 (1991).
- Thanos, S. Specific transcellular staining of microglia in the adult rat after traumatic degeneration of carbocyanine-filled retinal ganglion cells. Exp Eye Res. 55, 101-117 (1992).
