Summary
इस वीडियो में, हम का प्रदर्शन कैसे एक डोपामिनर्जिक चूहा मस्तिष्क स्लाइसें में पूरे सेल विन्यास में दर्ज न्यूरॉन में एक प्रवाहकत्त्व लागू करने के लिए. इस तकनीक को गतिशील दबाना कहा जाता है.
Protocol
1. स्लाइस तैयार
- मस्तिष्क एक हिल सूक्ष्म तक्षणी का उपयोग स्लाइस काटें. हम 240 सुक्ष्ममापी एक isoflurane anethetized Sprague Dawley चूहा (चार्ल्स नदी प्रयोगशालाओं) से क्षैतिज midbrain स्लाइस तैयार और सैन एंटोनियो संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति में टेक्सास विश्वविद्यालय के साथ अनुसार एक हिल सूक्ष्म तक्षणी (Microm एचएम 650V) का उपयोग.
- एक ऊष्मायन कक्ष में स्लाइस रखें जब तक आप रिकॉर्ड करने के लिए तैयार हैं. हम एक ऊष्मायन 32 डिग्री सेल्सियस पर गरम और कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव से भरा कंटेनर का उपयोग करें (aCSF, मिमी में): 126 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 2 नाह पीओ 4, 4 2 MgCl, 2 2 CaCl, 10 dextrose, 25 NaHCO 3, 1.3 ascorbic एसिड, 2.4 सोडियम पाइरूवेट और 0.05 glutathione.
2. Electrophysiological रिकॉर्डिंग
- जिसमें 35 में एक कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF) ° सी perfused किया जा रहा है intracellular रिकॉर्डिंग रिग टुकड़ा स्थानांतरण. हम में 1.2 के रूप में कि 2mm MgCl 2 इस्तेमाल किया और glutathione लोप किया गया था के अलावा एक ही aCSF उपयोग. क्षैतिज तैयार स्लाइस के लिए, हम आम तौर पर midline साथ टुकड़ा द्विविभाजित.
- लक्ष्य न्यूरॉन कल्पना. हम एक ढाल विपरीत इमेजिंग प्रणाली के साथ व्यक्तिगत substantia nigra डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स visualized.
- एक इलेक्ट्रोड एक इलेक्ट्रॉनिक इलेक्ट्रोड खींचने का उपयोग खींचो. हम 4-10 के एक टिप प्रतिरोध MΩ P97 micropipette डांड़ी (Sutter साधन कंपनी) का उपयोग कर के साथ इलेक्ट्रोड खींच.
- वांछित आंतरिक समाधान के साथ एक इलेक्ट्रोड भरें. कश्मीर - gluconate 138, 10 HEPES, 2 2 MgCl, 0.2 EGTA .0001 CaCl 2, 4 ना-एटीपी, ना 0.4-GTP: हम एक समाधान युक्त (मिमी में) का उपयोग करें. आंतरिक समाधान 7.3 के पीएच 1M KOH और 270-275 mOsms के एक osmolarity का उपयोग करने के लिए समायोजित किया गया था.
- वांछित न्यूरॉन पर gigaohm मुहर बनाओ. टूटना चूषण के साथ सील. यह एक पूरे सेल रिकॉर्डिंग का गठन किया. एक Multiclamp 700B प्रवर्धक हमारे विन्यास में इस्तेमाल किया गया था. एम्पलीफायर तो 'मैं = 0' वर्तमान दबाना मोड में रखा जाना चाहिए.
3. प्रवाहकत्त्व आवेदन के साथ गतिशील दबाना
- RTXI (www.rtxi.org) गतिशील दबाना कंप्यूटर पर निष्पादित किया गया था. एक कस्टम लिखा जिसमें एक NMDA रिसेप्टर मॉडल स्मृति में लोड किया गया था. सेल में वास्तविक समय में इंजेक्शन वर्तमान निम्न समीकरण द्वारा की गणना है:
मैं NMDA = छ NMDA * [1 / (1 + ([] / 3.57 मिलीग्राम) ई * (वी मीटर 0.062 *))] * (वि m - ई NMDA) जहां छ NMDA वांछित प्रवाहकत्त्व (एन एस में है; डिफ़ॉल्ट रूप से एन एस 0 के लिए सेट) [मिलीग्राम] मैग्नीशियम एकाग्रता (हमारे नीचे दिए गए उदाहरण में 1.5 मिमी) सेट है, ई NMDA NMDA रिसेप्टर (0 एम वी के लिए सेट) के लिए उलटा क्षमता है, और वी मीटर झिल्ली संभावित है एम्पलीफायर से मापा millivolts (में) सेल की. - गतिशील दबाना कंप्यूटर से आउटपुट एक एनालॉग से डिजिटल कनवर्टर के माध्यम से एम्पलीफायर की कमान इनपुट से जुड़ा था.
- प्रवर्धक आईसी वर्तमान दबाना मोड में रखा गया था.
- RTXI में अपने वांछित NMDA रिसेप्टर प्रवाहकत्त्व (40nS उदाहरण के लिए) दर्ज करें. आप कार्रवाई क्षमता की एक phasic फट देखना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, एक प्रवाहकत्त्व एक अनुरूप उत्पादन (चित्रा 1A, 'छ (टी)') के माध्यम से RTXI के लिए दिया जा सकता है. एक उचित स्केलिंग कारक RTXI के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए वोल्ट से सीमेंस संकेत कन्वर्ट.
4. प्रतिनिधि परिणाम
एक गतिशील दबाना का उपयोग प्रवाहकत्त्व के आवेदन के लिए एक सफल स्थापना 1A चित्र में दिखाया गया है. इस सेटअप का उपयोग करना, हम substantia nigra pars compacta में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन से एक पूरे सेल दैहिक रिकॉर्डिंग बनाया है. डोपामिनर्जिक कोशिकाओं को आमतौर पर कम दामों पर अनायास एक पेसमेकर की तरह पैटर्न के साथ आग. कार्रवाई क्षमता की एक फट गतिशील क्लैंप (चित्रा 1 बी) के साथ एक NMDA रिसेप्टर प्रवाहकत्त्व के phasic अनुप्रयोग द्वारा पैदा किया जा सकता है है.
चित्रा 1: एक NMDA रिसेप्टर गतिशील दबाना तकनीक का उपयोग प्रवाहकत्त्व के अनुप्रयोग. ए हार्डवेयर सेटअप intracellular रिकॉर्डिंग रिग और गतिशील दबाना कंप्यूटर के बीच कनेक्शन illustrating. बी कार्रवाई क्षमता की एक फट एक 40nS substantia nigra pars compacta डोपामिनर्जिक न्यूरॉन से एक पूरे सेल रिकॉर्डिंग में NMDA रिसेप्टर प्रवाहकत्त्व के आवेदन के द्वारा पैदा की है.
Discussion
गतिशील दबाना यहाँ प्रदर्शन तकनीक experimenter एक रिसेप्टर के सक्रियण के बिजली के प्रभावों की नकल करने की अनुमति देकर प्रत्यक्ष वर्तमान इंजेक्शन की पारंपरिक तकनीक के सुधार पर है. इस वीडियो में, हम पता चला है कि एक प्रभाव जोड़ने के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन का सहज गतिविधि के लिए एक NMDA रिसेप्टर के सक्रियण के कार्रवाई क्षमता की एक फट अर्थात् कर रहे हैं पैदा कर सकते हैं.
हार्डवेयर / सॉफ्टवेयर कार्यान्वयन के लचीलेपन के कारण, एक्सटेंशन की एक किस्म का इस्तेमाल किया जा सकता है. नकारात्मक से सकारात्मक इंजेक्शन वर्तमान का संकेत बंद किया जा सकता है, एक परिदृश्य जहां सक्रिय रिसेप्टर के प्रभाव एक न्यूरॉन से निकाल दिया जाता है का प्रतिनिधित्व. मॉडल न्यूरॉन्स, के फार्म का अंतर समीकरणों की एक श्रृंखला में प्रतिनिधित्व भी संख्यानुसार हल किया जा सकता है और experimenter छोटे नेटवर्क की जांच के लिए अनुमति देते हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम MH084494 CJL (), और MH079276 और NS060658 (कैप) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| K-gluconate anhydrous | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES | Reagent | Fisher Scientific | ||
| CaCl2 X 2H2O | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Ethylene glycol-bis(B-amin–thyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| MgATP | Reagent | MP Biomedicals | ||
| NaGTP | Reagent | MP Biomedicals | ||
| MgCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| NaHCO3 | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| KCl | Reagent | Fisher Scientific | ||
| NaH2PO4, Anhydrous | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Glucose | Reagent | Acros Organics | ||
| NaCl | Reagent | Fisher Scientific | ||
| CholCl | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pyruvate | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Ascorbic Acid | Reagent | Acros Organics | ||
| Glutathione | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective) | Microscope | Olympus Corporation | ||
| 2 A/D converters | Equipment | Any Supplier | ||
| Multiclamp 700B with CV-7B headstage | Equipment | Molecular Devices | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | ||
| Microfil syringe needles | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Micromanipulator | Equipment | Siskiyou, Inc. | ||
| Monitor | Equipment | Triview |
References
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- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).
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