Summary
בסרטון זה אנו מדגימים כיצד להחיל המוליכות לתוך נוירון דופאמין רשמה בתצורת תא שלם פרוסות המוח עכברוש. טכניקה זו נקראת מהדק דינמי.
Abstract
מדעני מוח ללמוד את תפקוד המוח על ידי חוקרת כיצד הנוירונים במוח מתקשרים. חוקרים רבים להסתכל על שינויים בפעילות החשמלית של אחד או יותר נוירונים בתגובה קלט בניסוי מבוקר. הפעילות החשמלית של הנוירונים יכול להיות מוקלט פרוסות המוח מבודד באמצעות מהדק טכניקות תיקון עם micropipettes זכוכית. באופן מסורתי, הנסיינים יכולים לחקות קלט עצביים בהזרקה ישירה של זרם דרך גירוי פיפטה, חשמל של תאים אחרים או קשרים axonal שנותרו פרוסה, או מניפולציה תרופתי על ידי קולטנים הממוקמים בקרום התא של הנוירונים המוקלט.
הזרקה ישירה הנוכחי יש את היתרונות של העברת צורת הגל הנוכחי מראש עם דיוק גבוה הזמני באתר של ההקלטה (בדרך כלל סומה). עם זאת, זה לא משנה את ההתנגדות של הקרום עצביים כמו תעלות יונים לא נפתחים פיזית. הזרקת נוכחי בדרך כלל מעסיקה פולסים מלבני ולכן אינו מודל קינטיקה של תעלות יונים. לבסוף, הזרקת הנוכחי לא יכול לחקות את השינויים הכימיים בתא המתרחשת עם פתיחת תעלות יונים.
רצפטורים יכול להיות מופעל באופן פיזי על ידי גירוי חשמלי או תרופתי. הנסיין יש דיוק טוב הזמני של הפעלת קולטן עם גירוי חשמלי של הפרוסה. הדיוק המרחבי עם זאת, אין הוא מוגבל של הפעלת קולטן ואת האופי המדויק של מה מופעל על הגירוי אינו ידוע. בעיה זו האחרונה ניתן להקל באופן חלקי על ידי סוכני תרופתי ספציפי. למרבה הצער, במהלך תקופה של הפעלת סוכנים תרופתי הוא איטי בדרך כלל ואת הדיוק המרחבי של תשומות על התא שנרשם אינו ידוע.
הטכניקה מהדק דינמי מאפשר הנסיין לשנות הנוכחי עבר ישירות אל תוך התא על סמך משוב בזמן אמת של פוטנציאל הממברנה של התא (רובינסון Kawai 1993, שארפ et al, 1993a, b;. לבדיקה, לראות פרינץ et al. 2004). זה מאפשר הנסיין לחקות את השינויים החשמליים המתרחשים באתר ההקלטה בתגובה הפעלת הקולטן. בזמן אמת שינויים הנוכחית להחיל נקבעים על ידי משוואה מתמטית מיושם בחומרה.
השתמשנו לאחרונה את הטכניקה מהדק דינמי לחקור את הדור של פרצי הפוטנציאלים לפעולה על ידי הפעלת phasic של קולטני NMDA בנוירונים דופאמינרגיים של nigra substantia Pars compacta (Deister et al, 2009;. Lobb et al, 2010).. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ההליכים הדרושים כדי להחיל מוליכות הקולטן NMDA לתוך נוירון דופאמין.
Protocol
1. פורסים הכנה
- חותכים פרוסות המוח באמצעות microtome רוטט. הכנו 240 מיקרומטר פרוסות המוח התיכון אופקי isoflurane-anethetized Sprague-Dawley חולדה (Charles River Laboratories) באמצעות microtome רוטט (Microm HM 650V) בהתאם מאוניברסיטת טקסס טיפול בבעלי חיים סן אנטוניו מוסדיים ועדת שימוש.
- שמרו את הפרוסות בתא דגירה עד שאתה מוכן להקליט. אנו משתמשים מיכל הדגירה מחומם ל 32 מעלות צלזיוס, מלאות בנוזל השדרתי מלאכותי (aCSF; מ"מ): 126 NaCl, KCl 2.5, 1.25 לאא 2 PO 4, 4 MgCl 2, 2 CaCl 2, 10 דקסטרוז, 25 NaHCO 3, 1.3 חומצה אסקורבית, 2.4 pyruvate נתרן 0.05 גלוטתיון.
2. אלקטרו הקלטה
- מעבירים את הפרוסה לקידוח הקלטה תאיים שבו הנוזל השדרתי מלאכותי (aCSF) בשעה 35 ° C מתבצע perfused. אנו משתמשים aCSF זהה 1.2 פרט לכך 2mm MgCl 2 היה בשימוש, גלוטתיון הושמט. עבור פרוסות מוכן אופקית, אנחנו בדרך כלל לחצות את הפרוסה לאורך קו האמצע.
- דמיינו את נוירון היעד. אנו substantia nigra דמיינו אדם נוירונים דופאמינרגיים עם מערכת לעומת שיפוע הדמיה.
- משוך אלקטרודה באמצעות אלקטרודה חולץ אלקטרוניים. אנו למשוך אלקטרודות עם התנגדות טיפ של 4-10 MΩ באמצעות micropipette P97 חולץ (החברה סאטר Instrument).
- מלאו אלקטרודה עם פתרון הפנימי הרצוי. אנו משתמשים תמיסה המכילה (מ"מ): 138-K-gluconate, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 0.2 EGTA, 0.0001 CaCl 2, 4 Na-ATP, 0.4 Na-GTP. הפתרון הפנימי הותאם ה-pH של 7.3 1M באמצעות KOH ו osmolarity של 270-275 mOsms.
- הפוך חותם gigaohm אל הנוירון הרצוי. שבר את החותם עם יניקה. זה מהווה הקלטה התא כולו. מגבר 700B Multiclamp היה בשימוש בתצורת שלנו. המגבר אמור להיות ממוקם במצב הנוכחי תפס את 'אני = 0 ".
3. מוליכות Application עם הצמד הדינמי
- RTXI (www.rtxi.org) הוצא להורג במחשב מהדק דינמי. המודל נכתב מותאם אישית המכיל הקולטן NMDA היה טעון לזיכרון. הנוכחי להיות מוזרק לתוך התא בזמן אמת מחושב על ידי המשוואה הבאה:
אני NMDA =-g-NMDA * [1 / (1 + ([Mg] / 3.57) * e (-V מ * 0.062))] * (V m - E-NMDA) שבו גר NMDA הוא המוליכות הרצויה (NS; כברירת מחדל, NS 0), [Mg] הוא ריכוז מגנזיום (מוגדר 1.5 מ"מ בדוגמא שלנו למטה), E-NMDA הוא פוטנציאל היפוך של הקולטן NMDA (מוגדר mV 0), ו-V m הוא פוטנציאל הממברנה של התא נמדד מן המגבר (ב millivolts). - פלט מהמחשב מהדק דינמי היה קשור קלט הפיקוד של המגבר דרך ממיר-to-Analog דיגיטליות.
- מגבר הושם במצב מהדק הנוכחי "IC".
- הזן המוליכות הרצויה הקולטן NMDA לתוך RTXI (למשל 40nS). אתה צריך לראות את פרץ phasic של פוטנציאל פעולה. לחלופין, מוליכות יכול להינתן RTXI באמצעות פלט אנלוגי (איור 1 א ', ג'(t) "). גורם דרוג המתאים יש להשתמש בתוך RTXI להמיר את האות וולט כדי סימנס.
4. נציג תוצאות
התקנה מוצלחת עבור יישום של מוליכות באמצעות מהדק דינמי מוצג באיור 1 א. באמצעות התקנה זו, עשינו הקלטה תא סומטי כל נוירון דופאמין ב nigra substantia Pars compacta. תאים דופאמינרגיים בדרך כלל אש באופן ספונטני במחירים נמוכים עם דגם דמוי קוצב לב. פרץ של פוטנציאל הפעולה יכול להיות מעוררים על ידי יישום phasic של מוליכות קולטן NMDA עם מהדק דינמי (איור 1B).
איור 1: יישום מוליכות קולטן NMDA באמצעות טכניקה מהדק דינמי. ההתקנה A. חומרה הממחישות את הקשר בין המתקן את ההקלטה תאיים והמחשב מהדק דינמי. ב 'פרץ של פוטנציאל פעולה הוא עורר על ידי יישום של מוליכות הקולטן NMDA 40nS בהקלטה תא שלם מתוך nigra substantia Pars compacta דופאמין נוירון.
Discussion
הטכניקה מהדק דינמי הפגינו כאן משפר עם הטכניקה המסורתית של הזרקת זרם ישר על ידי מתן הנסיין לחקות את ההשפעות החשמלית של הפעלת הקולטן. בסרטון הזה, אנו הראו כי ניתן להוסיף את ההשפעות של הפעלת הקולטן NMDA לפעילות ספונטנית של נוירון דופאמין, כלומר פרץ של פוטנציאל הפעולה הם מעוררים.
בשל הגמישות של יישום חומרה / תוכנה, מגוון רחב של הרחבות ניתן להשתמש. השלט של הזרם המוזרק ניתן להעביר משלילי לחיובי, המייצג תרחיש שבו את ההשפעות של הקולטן מופעל יוסר נוירון. נוירונים דגם, המיוצגת בדמות סדרה של משוואות דיפרנציאליות, ניתן לפתור מספרית ולאפשר הנסיין לחקור רשתות קטנות.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי MH084494 (CJL), ו MH079276 ו NS060658 (CAP).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| K-gluconate anhydrous | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES | Reagent | Fisher Scientific | ||
| CaCl2 X 2H2O | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Ethylene glycol-bis(B-amin–thyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| MgATP | Reagent | MP Biomedicals | ||
| NaGTP | Reagent | MP Biomedicals | ||
| MgCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| NaHCO3 | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| KCl | Reagent | Fisher Scientific | ||
| NaH2PO4, Anhydrous | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Glucose | Reagent | Acros Organics | ||
| NaCl | Reagent | Fisher Scientific | ||
| CholCl | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pyruvate | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Ascorbic Acid | Reagent | Acros Organics | ||
| Glutathione | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective) | Microscope | Olympus Corporation | ||
| 2 A/D converters | Equipment | Any Supplier | ||
| Multiclamp 700B with CV-7B headstage | Equipment | Molecular Devices | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | ||
| Microfil syringe needles | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Micromanipulator | Equipment | Siskiyou, Inc. | ||
| Monitor | Equipment | Triview |
References
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).
- Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting. J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).
- Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons. J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).
