Summary
在这个视频中，我们展示了如何应用到一个电导记录的多巴胺能神经元在大鼠脑片全细胞配置。这种技术被称为动态钳。
Abstract
神经科学家研究大脑的功能，通过调查如何神经元在大脑的沟通。许多研究者响应实验控制输入一个或多个神经元电活动的变化。可以记录在孤立的脑片膜片钳技术使用玻璃微量的神经元的电活动。传统上，实验者可以模仿当前直喷通过吸液管，电刺激其他细胞或切片，或记录细胞的神经细胞膜上的受体药理操纵剩余的轴索连接神经元的输入。
直接电流注入预定的电流波形，在录音的网站（通常是SOMA）通过与时间精度高的优点。然而，它不会改变神经细胞膜没有离子通道打开身体的抵抗力。通常采用矩形脉冲电流注入，因此不会离子通道的动力学模型。最后，电流注入不能模仿在细胞内的化学变化发生与离子通道的开放。
电气或药物刺激的受体可身体激活。实验者具有良好的切片电刺激的受体激活的时间精度。然而，是有限的受体激活和确切性质是什么刺激后激活的空间精度是未知的。这后一个问题可以得到部分缓解了由特定的药理制剂。不幸的是，药理代理激活的时间过程通常是缓慢和空间上记录的单元格的输入精度是未知的。
动态钳技术，使实验者以改变目前通过直接进入细胞的基础上（罗宾逊和Kawai 1993年，夏普等，1993年，B细胞的膜电位的实时反馈;审查，见普林茨等人，2004年）。这允许实验者模仿激活受体在录制现场发生的电气变化。施加电流的实时变化是由硬件实现的一个数学方程。
最近，我们采用动态钳技术调查阶段性激活NMDA受体，多巴胺能神经元黑质致密部（Deister等，2009; Lobb等，2010）。阵阵动作电位的产生。在这段视频中，我们证明，申请成多巴胺能神经元一个NMDA受体导所需的程序。
Protocol
1。切片的制备
- 使用振动切片机切脑片。我们准备从一个异氟醚anethetized的SD大鼠（Charles River实验室）240微米水平的脑切片，用振动切片机（MICROM航模650V）按照与美国德克萨斯大学圣安东尼奥机构动物护理和使用委员会。
- 在孵化室，直到你准备好记录片。我们使用一个孵化容器中加热至32 ° C和充满人工脑脊液（ACSF;毫米）：126 2.5氯化钠，氯化钾，1.25的NaH 2 PO 4，4氯化钙， 氯化镁 2，2 25 10葡萄糖， 碳酸氢钠 3 ， 1.3抗坏血酸，2.4丙酮酸钠和0.05谷胱甘肽。
2。电生理记录
- 将切片的细胞内记录钻机，其中人工脑脊液（ACSF）在35 ° C目前正在灌注。我们使用1.2相同学联，2MM MgCl 2的使用和谷胱甘肽被省略的除外。对于水平饮片，我们通常对开沿中线片。
- 可视化的目标神经元。我们可视个别黑质多巴胺能神经元，用渐变的对比成像系统。
- 使用电子电极拉马拉电极。我们拉了4-10的提示使用P97微管拉马（萨特仪器公司）兆欧电阻的电极。
- 填写所需的内部解决方案的一个电极。我们使用的解决方案，其中包含（毫米）：138的K -葡萄糖酸，10 HEPES，2 MgCl 2的，0.2 EGTA，0.0001氯化钙2，4的Na + - ATP，0.4钠GTP。内部的解决方案是调整到了7.3的pH值，使用1M KOH和270-275 mOsms渗透压。
- 到所需的神经元一个gigaohm密封。破裂的密封与吸。这构成了全细胞记录。 Multiclamp 700B放大器是在我们的配置使用。放大器应该被放置在“我= 0”的电流钳模式。
3。电导应用与动态钳
- RTXI（www.rtxi.org）被执行动态钳计算机。一个自定义的模型，其中包含一个NMDA受体被加载到内存中。被注射到细胞中实时电流是由下列公式计算：
我NMDA受体 = - G NMDA受体 * [1 /（1 +（[MG] / 3.57）* E（V M * 0.062））] *（V M -电子NMDA受体 ），其中G NMDA受体所需的电导（ns中;默认设置为0纳秒），[毫克]是镁离子浓度（在下面的代码设置到1.5毫米），发送NMDA受体是NMDA受体（设置为0 mV时）逆转潜力，和V M是膜电位测量放大器（毫伏）的细胞。 - 从动态钳计算机的输出通过一个模拟数字转换器连接到放大器的命令输入。
- 放大器放置在“IC”电流钳模式。
- 输入您所需的NMDA受体导成RTXI（如40ns的）。您应该看到一个动作电位的阶段性爆发。此外，电导可以通过模拟输出（图1A，“G（T）”），以RTXI。一个适当的缩放因子必须使用内RTXI从伏西门子信号转换。
4。代表性的成果
如图1a所示，一个成功的应用程序使用动态钳电导设置。使用此设置，我们在黑质致密部多巴胺能神经元的整个细胞体记录。多巴胺能细胞在低利率通常火自发心脏起搏器的格局。一阵动作电位可以诱发阶段性应用与动态钳（图1B）的NMDA受体电导。
图1：一个电导NMDA受体的动态钳技术的应用。 A.硬件设置说明细胞内记录钻机和动态钳计算机之间的连接。 B.一个动作电位的爆发是引起应用程序从一个黑质致密部多巴胺能神经元的全细胞记录在一个40ns的NMDA受体电导。
Discussion
这里演示的动态钳技术提高后，直接注入电流的传统技术，使实验者模仿受体激活电效应。在这段视频中，我们已经表明，人们可以添加效果，激活NMDA受体的多巴胺能神经元的自发活动，即动作电位的爆发，是诱发。
由于硬件/软件实施的灵活性，各种各样的扩展都可以使用。注入电流的符号可以切换由负转正，较激活受体的影响是从一个神经元中删除的情况下。模型的神经元，形成了一系列微分方程，也可以是数值求解，并允许实验者调查的小型网络。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由MH084494（CJL），MH079276和NS060658（CAP）的支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| K-gluconate anhydrous | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES | Reagent | Fisher Scientific | ||
| CaCl2 X 2H2O | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Ethylene glycol-bis(B-amin–thyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| MgATP | Reagent | MP Biomedicals | ||
| NaGTP | Reagent | MP Biomedicals | ||
| MgCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| NaHCO3 | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| KCl | Reagent | Fisher Scientific | ||
| NaH2PO4, Anhydrous | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Glucose | Reagent | Acros Organics | ||
| NaCl | Reagent | Fisher Scientific | ||
| CholCl | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pyruvate | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Ascorbic Acid | Reagent | Acros Organics | ||
| Glutathione | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective) | Microscope | Olympus Corporation | ||
| 2 A/D converters | Equipment | Any Supplier | ||
| Multiclamp 700B with CV-7B headstage | Equipment | Molecular Devices | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | ||
| Microfil syringe needles | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Micromanipulator | Equipment | Siskiyou, Inc. | ||
| Monitor | Equipment | Triview |
References
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).
- Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting. J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).
- Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons. J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).
