Summary
В этом видео показано, как применять проводимости в дофаминергических нейронов, записанные в целом конфигурации клетки в срезах мозга крыс. Эта техника называется динамическим зажимом.
Protocol
1. Подготовка фрагментов
- Вырезать мозга ломтиками использованием вибрирующей микротоме. Мы подготовили 240 мкм горизонтальных срезов мозга от ИФ-anethetized Sprague-Dawley крыс (Charles River Laboratories) использованием вибрирующей микротома (Microm HM 650V) в соответствии с Техасского университета в Сан-Антонио Институциональные уходу и использованию животных комитета.
- Держите ломтики в камере инкубации пока не будете готовы к записи. Мы используем инкубационный контейнер нагревается до 32 ° C и наполнен искусственной цереброспинальной жидкости (aCSF; в мм): 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 2 MgCl 2, CaCl 2, 10 декстрозы, 25 NaHCO 3, 1,3 аскорбиновой кислоты, 2,4 пируват натрия и 0,05 глутатиона.
2. Электрофизиологические Запись
- Передача квант внутриклеточных установки записи, в которых искусственным спинномозговой жидкости (aCSF) при 35 ° C в настоящее время перфузии. Мы используем те же aCSF как и в 1,2 исключением того, что 2 мМ MgCl 2 был использован и глутатион был опущен. Для горизонтально подготовленные ломтики, которые мы обычно делят пополам ломтик вдоль средней линии.
- Визуализируйте цель нейрона. Мы визуализировать отдельные черной субстанции дофаминергических нейронов с изображениями система отличие градиент.
- Вытяните электрода с помощью электронной съемник электрода. Тянем электродами с наконечником сопротивлением 4-10 МОм использованием P97 микропипетки съемник (Саттер Instrument Company).
- Заполнить электрод с желаемой внутреннее решение. Мы используем раствор, содержащий (в мм): 138 К-глюконат, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 0,2 EGTA, 0.0001 2 CaCl, 4 Na-АТФ, 0,4 Na-GTP. Внутренние раствора доводили до рН 7,3 использованием 1М КОН и осмолярность 270-275 mOsms.
- Сделать gigaohm печать на нужный нейрон. Разрыв печать с всасывания. В этом заключается весь записи клетки. Усилитель Multiclamp 700B был использован в нашей конфигурации. Усилитель должен быть помещен в текущем режиме зажим 'I = 0'.
3. Проводимость приложения с динамической Clamp
- RTXI (www.rtxi.org) был выполнен на компьютере динамическую зажимом. Пользовательских письменного модели, содержащей NMDA-рецепторов был загружен в память. Тока, вводят в клетку в реальном времени рассчитывается по следующей формуле:
Я NMDA =-г NMDA * [1 / (1 + ([Mg] / 3,57) * е (-V м * 0,062))] * (V м - E NMDA), где г NMDA является искомой проводимости (в нс; По умолчанию установлено в 0 нс), [Mg] является концентрация магния (устанавливается до 1,5 мм в нашем примере ниже), E NMDA есть потенциал реверсии для NMDA-рецепторов (установлен в 0 мВ) и V м мембранный потенциал ячейки измеряется от усилителя (в милливольтах). - Вывод динамических компьютер зажим был подключен к командной вход усилителя через аналого-цифровой преобразователь.
- Усилитель был помещен в текущем режиме зажим 'IC'.
- Введите желаемый NMDA рецепторов проводимости в RTXI (например 40nS). Вы должны увидеть фазовый взрыв потенциалов действия. Кроме того, проводимость может быть предоставлена RTXI через аналоговый выход (рис. 1А, "г (т) '). Соответствующий коэффициент масштабирования следует использовать в течение RTXI для преобразования сигнала от вольт для Siemens.
4. Представитель Результаты
Успешной установки для применения проводимости с помощью динамического зажима показан на рисунке 1а. С помощью этой установки, мы сделали все соматической клетки записи с дофаминергических нейронов в черной субстанции Парс компактов. Дофаминергической клетки обычно спонтанно огонь по низким ценам с кардиостимулятором, как шаблон. Взрыв потенциалы действия могут быть вызваны фазовыми применения NMDA-рецепторов проводимости с динамическим зажим (рис. 1В).
Рисунок 1: Применение NMDA-рецепторов проводимости с помощью динамического техника зажима. А. Аппаратное обеспечение иллюстрирующие связь между внутриклеточными установки записи и динамических компьютер зажимом. Б. взрыв потенциалов действия вызывается путем применения 40nS NMDA-рецепторов проводимость в целом запись клетки от черной субстанции Парс компактов дофаминергических нейронов.
Discussion
Динамический метод зажима продемонстрировали здесь улучшает традиционную технику постоянного тока инъекции, позволяя экспериментатором, чтобы имитировать электрических эффектов активации рецептора. В этом видео, мы показали, что можно добавить эффекты активации NMDA-рецепторов к спонтанной активности дофаминергических нейронов, то есть взрыв потенциалов действия вызываются.
Благодаря гибкости аппаратной / программной реализации, различные расширения могут быть использованы. Знак вводится ток может быть включен с отрицательного на положительный, что составляет сценарий, при котором эффекты активированного рецептора удаляется из нейрона. Модель нейронов, представить в виде серии дифференциальных уравнений, также может быть решена численно и позволяет экспериментатору для исследования малых сетей.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана MH084494 (CJL), а MH079276 и NS060658 (CAP).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| K-gluconate anhydrous | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES | Reagent | Fisher Scientific | ||
| CaCl2 X 2H2O | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Ethylene glycol-bis(B-amin–thyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| MgATP | Reagent | MP Biomedicals | ||
| NaGTP | Reagent | MP Biomedicals | ||
| MgCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| NaHCO3 | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| KCl | Reagent | Fisher Scientific | ||
| NaH2PO4, Anhydrous | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Glucose | Reagent | Acros Organics | ||
| NaCl | Reagent | Fisher Scientific | ||
| CholCl | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pyruvate | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Ascorbic Acid | Reagent | Acros Organics | ||
| Glutathione | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective) | Microscope | Olympus Corporation | ||
| 2 A/D converters | Equipment | Any Supplier | ||
| Multiclamp 700B with CV-7B headstage | Equipment | Molecular Devices | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | ||
| Microfil syringe needles | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Micromanipulator | Equipment | Siskiyou, Inc. | ||
| Monitor | Equipment | Triview |
References
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).
- Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting. J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).
- Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons. J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).
