Summary
In deze video laten we zien hoe een geleiding toe te passen in een dopaminerge neuron opgenomen in de whole cell configuratie in hersenen van de rat plakjes. Deze techniek heet de dynamische klem.
Abstract
Neurowetenschappers onderzoek naar de functie van de hersenen door te onderzoeken hoe neuronen in de hersenen communiceren. Veel onderzoekers kijken naar veranderingen in de elektrische activiteit van een of meer neuronen in reactie op een experimenteel-gecontroleerde input. De elektrische activiteit van neuronen kan worden opgenomen in geïsoleerde hersenen plakjes met behulp van patch clamp technieken met glas micropipetten. Traditioneel, experimentatoren kunnen neuronale ingang na te bootsen door middel van directe injectie van stroom door de pipet, elektrische stimulatie van de andere cellen of de resterende axonale verbindingen in de slice, of farmacologische manipulatie door receptoren die zich op de neuronale membraan van de cel opgenomen.
Gelijkstroom injectie heeft de voordelen van het passeren van een vooraf bepaalde stroomvorm met een hoge temporele precisie op de plaats van de opname (meestal de soma). Dit betekent echter niet verandert de weerstand van de neuronale membraan zoals ion kanalen geen fysiek worden geopend. Huidige injectie heeft meestal rechthoekige pulsen en dus niet het model van de kinetiek van ionkanalen. Tot slot kan de huidige injectie niet na te bootsen de chemische veranderingen in de cel die zich voordoet bij de opening van ionkanalen.
Receptoren kunnen fysiek worden geactiveerd door elektrische of farmacologische stimulatie. De experimentator heeft een goede temporele precisie van de receptor activering met elektrische stimulatie van de slice. Echter, er is beperkte ruimtelijke nauwkeurigheid van de receptor activering en de precieze aard van wat wordt geactiveerd bij stimulatie is onbekend. Dit laatste probleem kan gedeeltelijk worden beperkt door specifieke farmacologische middelen. Helaas, het tijdsverloop van de activering van farmacologische middelen is meestal langzaam en de ruimtelijke precisie van inputs op de opgenomen cellen is onbekend.
De dynamische clamp techniek kan een onderzoeker om de huidige instelling doorgegeven direct in de cel op basis van real-time feedback van de membraanpotentiaal van de cel (Robinson en Kawai 1993, Sharp et al., 1993a, b;. Voor het overzicht, zie Prinz et Al. 2004). Hierdoor kan een onderzoeker van de elektrische veranderingen die zich voordoen op de plaats van de opname na te bootsen in reactie op de activering van een receptor. Real-time veranderingen in de toegepaste stroom wordt bepaald door een wiskundige vergelijking geïmplementeerd in hardware.
We hebben kort geleden heeft gebruikt de dynamische clamp techniek om de generatie van de uitbarstingen van actiepotentialen onderzoeken door fasisch activatie van NMDA-receptoren in de dopaminerge neuronen van de substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009;. Lobb et al., 2010.). In deze video, tonen we de procedures die nodig zijn om een NMDA receptor geleiding toe te passen in een dopaminerge neuron.
Protocol
1. Slice Voorbereiding
- Gesneden plakjes hersenen met behulp van een trillende microtoom. Wij bereid 240 micrometer horizontale middenhersenen segmenten van een isofluraan-anethetized Sprague-Dawley rat (Charles River Laboratories) met behulp van een trillende microtoom (Microm HM 650V) in overeenstemming met de Universiteit van Texas in San Antonio Institutional Animal Care en gebruik Comite.
- Houd de plakken in een incubatiekamer totdat u klaar bent om op te nemen. We maken gebruik van een incubatie container verwarmd tot 32 ° C en gevuld met kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF, in mm): 126 NaCl, KCl 2,5, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl 2, 2 CaCl2, 10 dextrose, 25 NaHCO 3, 1,3 ascorbinezuur, 2,4 natrium pyruvaat en 0,05 glutathion.
2. Elektrofysiologische opname
- Breng de slice om de intracellulaire opname tuig, waarin een kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) bij 35 ° C wordt doorbloed. We gebruiken dezelfde aCSF als in 1.2, behalve dat 2 mM MgCl 2 werd gebruikt en glutathion was weggelaten. Voor horizontaal bereid plakjes, we meestal halveren de plak over de middellijn.
- Visualiseer het doel neuron. We individuele substantia nigra dopaminerge neuronen gevisualiseerd met een gradiënt contrast imaging systeem.
- Trek een elektrode met behulp van een elektronische elektrode trekker. We trekken elektroden met een fooi van 4-10 MΩ weerstand met behulp van een P97 Micropipet trekker (Sutter Instrument Company).
- Vul een elektrode met de gewenste interne oplossing. We maken gebruik van een oplossing die (in mm): 138 K-gluconaat, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 0,2 EGTA, 0,0001 CaCl 2, 4 Na-ATP, 0.4 Na-GTP. De interne oplossing werd ingesteld op een pH van 7,3 met behulp van 1M KOH en een osmolariteit van 270-275 mOsms.
- Maak een gigaohm afdichting op de gewenste neuron. Breuk van de afdichting met afzuiging. Dit is een hele cel opname. Een Multiclamp 700B versterker werd gebruikt in onze configuratie. De versterker moet dan worden geplaatst in de huidige klem mode van de 'I = 0'.
3. Geleiding Toepassing met Dynamic klem
- RTXI (www.rtxi.org) werd uitgevoerd op de dynamische klem computer. Een op maat geschreven model met een NMDA-receptor werd in het geheugen geladen. De huidige te injecteren in de cel in real-time wordt berekend door de volgende vergelijking:
I = NMDA-g NMDA * [1 / (1 + ([Mg] / 3,57) * e (-V m * 0,062))] * (V m - E NMDA), waar g NMDA is de gewenste geleiding (in ns; standaard ingesteld op 0 nS), [Mg] is de magnesium concentratie (ingesteld op 1,5 mM in ons voorbeeld hieronder), E NMDA is de omkering potentieel voor de NMDA-receptor (ingesteld op 0 mV), en V m is de membraanpotentiaal van de cel gemeten vanaf de versterker (in millivolt). - De output van de dynamische klem computer was aangesloten op de Command ingang van de versterker via een analoge-naar-digitaal converter.
- De versterker werd geplaatst in de huidige stand van de klem 'IC'.
- Vul uw gewenste NMDA receptor geleiding in RTXI (bijv. 40nS). Ziet u een driefase uitbarsting van actiepotentialen. Als alternatief kan een geleiding worden gegeven aan RTXI via een analoge uitgang (Figuur 1A, 'g (t)'). Een geschikte scaling factor moet worden gebruikt binnen RTXI om het signaal van volt naar Siemens om te zetten.
4. Representatieve resultaten
Een succesvolle setup voor de toepassing van een geleiding met behulp van de dynamische klem is weergegeven in figuur 1A. Met behulp van deze opstelling hebben we een hele cel somatische opname van een dopaminerge neuron in de substantia nigra pars compacta. Dopaminerge cellen meestal spontaan brand bij lage tarieven met een pacemaker-achtig patroon. Een uitbarsting van actiepotentialen kunnen worden opgeroepen door fasisch toepassing van een NMDA-receptor geleiding met dynamische klem (Figuur 1B).
Figuur 1: Toepassing van een NMDA-receptor geleiding met behulp van de dynamische clamp techniek. A. Hardware setup ter illustratie van de verbindingen tussen de intracellulaire opname rig en dynamische klem computer. B. Een uitbarsting van actiepotentialen wordt opgeroepen door de toepassing van een 40nS NMDA-receptor geleiding in een whole cell opname van een substantia nigra pars compacta dopaminerge neuronen.
Discussion
De dynamische clamp techniek hier gedemonstreerd verbetering ten opzichte van de traditionele techniek van directe inspuiting huidige doordat de experimentator om de elektrische effecten van de activering van een receptor na te bootsen. In deze video, hebben we laten zien dat men de effecten toe te voegen van de activering van een NMDA-receptor op de spontane activiteit van de dopaminerge neuron, dat wil zeggen een uitbarsting van actiepotentialen worden opgewekt.
Door de flexibiliteit van de hardware / software implementatie, kan een scala aan uitbreidingen worden gebruikt. Het teken van de geïnjecteerde stroom kan worden omgeschakeld van negatief naar positief, wat neerkomt op een scenario waarin de effecten van de geactiveerde receptor wordt verwijderd uit een neuron. Model neuronen, vertegenwoordigd in de vorm van een reeks van differentiaalvergelijkingen, kan ook numeriek worden opgelost en laat de onderzoeker om kleine netwerken te onderzoeken.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door MH084494 (CJL), en MH079276 en NS060658 (CAP).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| K-gluconate anhydrous | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES | Reagent | Fisher Scientific | ||
| CaCl2 X 2H2O | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Ethylene glycol-bis(B-amin–thyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| MgATP | Reagent | MP Biomedicals | ||
| NaGTP | Reagent | MP Biomedicals | ||
| MgCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| NaHCO3 | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| KCl | Reagent | Fisher Scientific | ||
| NaH2PO4, Anhydrous | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Glucose | Reagent | Acros Organics | ||
| NaCl | Reagent | Fisher Scientific | ||
| CholCl | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pyruvate | Reagent | Fisher Scientific | ||
| Ascorbic Acid | Reagent | Acros Organics | ||
| Glutathione | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective) | Microscope | Olympus Corporation | ||
| 2 A/D converters | Equipment | Any Supplier | ||
| Multiclamp 700B with CV-7B headstage | Equipment | Molecular Devices | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | ||
| Microfil syringe needles | Equipment | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Micromanipulator | Equipment | Siskiyou, Inc. | ||
| Monitor | Equipment | Triview |
References
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).
- Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting. J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).
- Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons. J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).
