Summary
نقدم طريقة لتحضير شرائح عضوي النمط من أجنة فئران في منتصف الحمل للزراعة والتصوير مرور الوقت ، من ثمرة الأعصاب الطرفية.
Abstract
لأغراض كثيرة ، وزراعة الأجنة الحية الماوس السابقين وشرائح عضوي النمط غير مرغوب فيه. على سبيل المثال ، ونحن توظيف خط الماوس المعدلة وراثيا (tauGFP) الذي يعبر حصرا نسخة مطورة من البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) في جميع الخلايا العصبية في تطور الجهاز العصبي المركزي والمحيطي 1 ، مما يسمح لكلا احتمال الفيلم من تعصيب وforelimb والتلاعب هذه العملية مع تقنيات والدوائية الجينية 2. المعلمة الأكثر أهمية في زراعة ناجحة لشريحة الثقافات مثل هذا الأسلوب الذي يتم إعداد الشرائح. بعد اختبارات مكثفة من مجموعة متنوعة من الأساليب ، أننا وجدنا أن vibratome هو الجهاز الأمثل لشريحة الأجنة بحيث يؤدي بشكل روتيني في ثقافة الذي يوضح جدوى على مدى أيام عدة ، والأهم من ذلك أنه في عصر تتطور بطريقة محددة. في منتصف الحمل الأجنة ، ويشمل هذا نتاج طبيعي للأعصاب العمود الفقري من الحبل الشوكي والعقد الجذرية الظهرية إلى أهدافهم في محيط والتصميم السليم للأنسجة العضلات والهيكل العظمي.
في هذا العمل ، فإننا نقدم وسيلة لمعالجة الأجنة كلها اليوم الجنينية (E) E10 E12 لفي 300 -- 400 ميكرومتر شرائح لزراعة الأنسجة في حاضنة الثقافة الموحدة ، والتي يمكن دراستها لمدة تصل إلى يومين بعد إعداد شريحة. حاسمة بالنسبة لنجاح هذا النهج هو استخدام vibratome لشريحة كل جنين agarose جزءا لا يتجزأ. ويتبع ذلك عن طريق زراعة شرائح عند إدراج Millicell غشاء الثقافة وضعت بناء على حجم صغير من المتوسط ، مما أدى إلى واجهة تقنية الثقافة. القمامة واحدة بمتوسط 7 أجنة بشكل روتيني وتنتج ما لا يقل عن 14 شرائح (2-3 شرائح من منطقة جنين في forelimb) ، والذي يختلف قليلا بسبب عمر الأجنة وكذلك سمك الشرائح. حوالي 80 ٪ من الشرائح المثقفة تظهر ثمرة العصبية ، والتي يمكن قياسها على زراعة 2 througout الفترة. وأظهرت النتائج ممثل باستخدام سطر tauGFP الماوس.
Protocol
الجزء 1 : الاستعداد للتشريح والتثقيف.
- إعداد لوحات 10 سم ، وزراعة الأنسجة مع تشريح المتوسطة (DMEM ، و 25 ٪ HBSS 1X ، و 25 ٪ مصل بقري جنيني والجلوكوز بنسبة 0.5 ٪ ، 1 الجلوتامين ملي و 2.5 ملي HEPES ، ودرجة الحموضة 7.3) و 3 سم Millicell - CM - 0.4 ميكرومتر الثقافة إدراج والحفاظ على غشاء في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- حرارة منخفضة بنسبة 4 ٪ نقطة ذوبان agarose في برنامج تلفزيوني في الميكروويف وابقائه على لوحة التسخين بحيث يبقى في حوالي 37 درجة مئوية.
- ملء 10 سم ، والبكتريولوجية أطباق بتري مع برنامج تلفزيوني (140 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 2.7 ملي بوكل ، 10 ملي نا 2 هبو 4 ، ص 2 1.8mM KH 4) ووضعت على الجليد.
- إعداد مشراح جهاز التبريد أو ضمان تخزين وتبريد علبة عازلة العناصر في الثلاجة لتبرد قبل ذلك.
الجزء 2 : تضمين الأجنة.
- تشريح الأجنة من الرحم ودراستها مع مجهر مقلوب an الفلورسنت للتحقق من التعبير GFP.
- أجنة مكان في صحن مقلوب بيتري 10 سم ، وتوجيهها باستخدام شرائط الورق Whatman لإزالة PBS المفرطة.
- تنطبق على agarose جنين لاصلاحها في هذا الموقف. اسمحوا agarose يصلب.
- الحد من المنطقة المحيطة بها الجنين عن طريق خفض بشفرة حلاقة.
- تدوير الجنين جزءا لا يتجزأ من على الجانب الآخر.
- تطبيق agarose إضافية على الأنسجة الجنينية للتأكد من أن يتم تضمين تماما الجنين.
- إعداد agarose كتلة مع حواف نظيفة وعلى جبل تشوك vibratome باستخدام وكتايت 406 ، الغراء خاص يشبه "الغراء Krazy".
الجزء 3 : التقطيع الداخلي.
- إعداد علبة عازلة precooled وعنصر التبريد.
- إدراج تشوك مع نسيج لاصق وإضافة 1X HBSS (كا 2 + 2 + ملغ خالية HBSS ، 10 العازلة HEPES الرقم الهيدروجيني 7.3 ملليمتر و 500 U / البنسلين مل / الستربتوميسين) حتى تغطيتها.
- إدراج وإصلاح precleaned شفرة مشراح (70 ٪ إيثانول).
- أبقى شرائح 450 ميكرون ونقلها باستخدام الزجاج تقصير ماصات باستور في زراعة الأنسجة لوحات على الجليد -- إعداد 350.
- باستخدام زوج من الملقط ، agarose إزالة بعناية من كل شريحة ، ونقل إلى Millicell الأغشية الثقافة. يمكن تربيتها حوالي 4 شرائح على واحد في لوحة الغشاء نسيج الثقافة 10 سم ، وملأت مع 6 مل من المتوسط الثقافة.
- احتضان شرائح عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 (متوسطة الثقافة : DMEM ، و 25 ٪ HBSS 1X ، و 25 ٪ مصل بقري جنيني والجلوكوز بنسبة 0.5 ٪ ، 1MM الجلوتامين ، و 2.5 ملي HEPES ، ودرجة الحموضة 7.3). إذا كان واحد ينفذ الوقت الفاصل بين التصوير سلسلة ينبغي للمرء أن إبقاء حجم ثابت المتوسطة. في حالة من سلسلة توقيت التصوير لفترة زمنية قصيرة يكفي لمغادرة المتوسط كما هو عليه. الثقافة لمدة أطول فترات التغييرات الموصى بها بعد 12-20 ساعة.
الجزء 4 : التصوير ثمرة العصب الشوكي في المجهر.
- صورة الأعصاب في العمود الفقري بوضع زراعة الأنسجة 10 سم ، لوحة ، والتي تحتوي على أغشية الثقافة Millicell مع شرائح ، تحت مجهر الفلورسنت تستقيم.
- تسمية اتجاه الأغشية الثقافة Millicell على خشبة المسرح المجهر لموقف صحيح أثناء التصوير نقطة في المرة القادمة.
- ثمرة صورة العصب الشوكي باستخدام 4X (الفتحة العددية [NA] 0.1) ، 10X (NA 0.3) ، أو 20X (NA 0.5) الأهداف.
الشكل 1 يبين سلسلة التصوير تصور ثمرة العصب الفقري خلال 20 ساعة من الثقافة مع أهداف 4x و10X.
سلسلة التصوير الرقم 1 من ثمرة العصب الشوكي في شريحة عرضية من جنين tauGPF متماثل. * = الخلايا العصبية الحركية في الحبل الشوكي بطني ، السهم = DRG. وأشار الظهراني (D) - بطني (V) محور شريحة. Scalebars : 200 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في المقارنة واسعة من الأساليب لإعداد الثقافات شريحة الجنينية من أجنة فئران في منتصف الحمل (E10 -- E12) ، وقد لاحظنا أن vibratome تنتج دون شك نتائج الأكثر موثوقية فيما يتعلق جدوى على حد سواء العام للثقافات واستنساخ أنماط ثمرة العصبية. في المقابل ، أعدت شرائح الأنسجة باستخدام المروحية McIlwain 3 ثبت أن inviable تماما. نحن العاملين في الأصل طريقة المقصلة 4 ، التي يمكن أن تكون القمامة بأكمله في وقت واحد على استعداد للأجنة عن طريق تشريح مع أسلاك التنجستين ملفوفة حول قطع متسلسل صر لإنتاج 400 ميكرومتر الأبواب 1. على الرغم من أن هذه التقنية قد ميزة سرعة إعداد وحققت ذلك في معظم مقطع واحد قابلة للحياة في الجنين ، وأظهرت قدرا كبيرا من التباين في نمو المعلمات. لهذه الأسباب ، فإننا نرى أن الأسلوب القائم على vibratome هو الخيار الأفضل على الرغم من وقتا أطول في الإعداد. على الرغم من أن هذا الحل يتطلب بالضرورة vibratome ، فإن النتائج تكون متفوقة بشكل كبير على ما تم تحقيقه من خلال المناهج الأخرى "منخفضة التكنولوجيا" ، ويبرر بالتالي الاستثمار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
الكتاب يعترف المصدر الأصلي للفكرة لأداء ثقافة شريحة على أجنة الفئران 5. نود أن نعترف يواكيم كيرش للحصول على الدعم السخي والعلمية ديجين آنا لدينا بوصفها gofer أثناء التصوير. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (دويتشه Forschungsgemeinschaft : Sonderforschungsbereich 488 ، Teilprojekt B7/B9) ، وجامعة هايدلبرغ (التميز الكتلة الشبكات الخلوية).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS 10x | GIBCO, by Life Technologies | 14180 | |
| Dissection tools | Fine Science Tools | various | |
| L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Whatmann paper | Whatman, GE Healthcare | 3030917 | |
| Shortened firepolished pipettes | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41966 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 10270-106 | |
| Pen Strep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-glutamine 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Vibratome | Microm International | HM 650 V | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
| analySIS | Soft Imaging System | ||
| Millicell-CM inserts | EMD Millipore | PICMORG 50 | |
| 10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | |
| LOCTITE 406 | Henkel Corp | 142580 | |
| Razor blades | Thermo Fisher Scientific, Inc. | none | |
| Dissecting microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| HEPES | Carl Roth Gmbh | 9105.2 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| x4 objective | Olympus Corporation | PL series | |
| x10 objective | Olympus Corporation | UPLFL –PH series | |
| Filter | Olympus Corporation | U-MNIBA2 | |
| CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | |
| Equipment for heated chamber | Leica Microsystems | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |
References
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
- Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W.
