Summary
Biz periferik sinir akıbet ekimi ve zaman atlamalı görüntüleme için gebeliğin orta fare embriyo Organotipik dilim hazırlamak için bir yöntem mevcut.
Abstract
Birçok amaç için, fare embriyoları ex vivo Organotipik dilimleri olarak ekimi arzu edilir. Örneğin, biz, hem filmin innervasyon imkanı sağlayan, yeşil flüoresan protein (EGFP) geliştirilmiş bir versiyonu sadece gelişmekte olan santral ve periferal sinir sistemi 1 bütün nöronlar ifade edildiği bir transgenik fare hattı (tauGFP) istihdam farmakolojik ve genetik teknikleri ile 2 ön ayakları ve bu süreci yönetmek için. Böyle bir dilim kültürlerin başarılı yetiştiriciliğinde en kritik parametre dilimleri tarafından hazırlanan bir yöntemdir. Çeşitli yöntemler geniş test ettikten sonra, bir vibratome, onlar, birkaç günlük bir süre içinde canlılığını ve en önemlisi gösteren bir kültür rutin Sonuç olarak bu tür embriyoların dilim mümkün olan en iyi cihaz olduğunu bulduk, bir yaş gelişir özel bir şekilde. Gebeliğin orta embriyolar için, bu, omurilik ve dorsal kök gangliyon, çevre ve iskelet ve kas dokusu uygun belirlenmesi hedeflerine spinal sinirlerin normal akıbet içerir.
400 mikrometre dilim dilim hazırlandıktan sonra iki gün için çalışılan bir standart doku kültürü inkübatör, tarım için - Bu çalışmada, 300 içine (E) E10 E12 embriyonik gün bütün embriyolar işlenmesi için bir yöntem mevcut. Bu yaklaşımın başarısı için kritik her agaroz gömülü embriyo dilim vibratome kullanılmasıdır. Bu bir arayüz kültür tekniği ile sonuçlanan orta küçük bir hacim üzerine yerleştirilen Millicell kültür membran ekler, üzerine dilim ekimi tarafından takip edilmektedir. 7 embriyoların ortalama bir çöp rutin nedeniyle embriyoların yaşın yanı sıra dilimlerin kalınlığı biraz değişir en az 14 dilim (2-3 dilim embriyo başına ön ayakları bölgenin), üretir. Kültürlü dilim yaklaşık% 80'i, tüm kültür süresi 2 boyunca ölçülen sinir akıbet göstermektedir. TauGFP fare satırını kullanarak Temsilcisi sonuçlar gösterilmiştir.
Protocol
Bölüm 1: dilimleme ve kültür için hazırlanması.
- , Orta (DMEM 1x HBSS,% 25 fetal sığır serumu,% 0.5 glikoz, 1 mM glutamin, 2,5 mM Hepes, pH 7.3,% 25) ve 3 cm Millicell-CM 0.4 mikron kültür dilimleme 10 cm doku kültürü tabak hazırlayın membran ekler ve 37 ° inkübatör tutmak ° C ve% 5 CO 2.
- Yaklaşık 37 kalır böylece mikrodalga PBS içinde% 4 düşük erime noktası agaroz Isı ve ısıtma plakası tutmak ° C
- PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8mm KH 2 PO 4) ve buz üzerinde yer 10 cm bakteriyolojik Petri kapları doldurun.
- Mikrotom soğutma cihazı kurun veya tampon tepsisi ve soğutma elemanları öncesi cool dondurucuda saklanan sağlamak.
Bölüm 2: Embriyo gömme.
- Embriyolar rahim inceleyin ve GFP ifade kontrol etmek için ters bir floresan mikroskop ile incelenmesi.
- 10 cm ters bir Petri kabı ve yönlendirmek onları yerleştirin embriyolar whatman kağıt şeritleri kullanarak aşırı PBS kaldırmak için.
- Bu pozisyonda onu düzeltmek için embriyo üzerinde agaroz uygulayın. Agaroz katılaşmaya.
- Bir jiletle keserek embriyo çevreleyen alanı sınırlayın.
- Diğer yüzüne gömülü embriyo döndürün.
- Embriyo tamamen gömülü olduğundan emin olmak için ek agaroz embriyonik doku uygulayın.
- Loctite 406, "Krazy Glue" 'e benzer özel bir tutkal kullanarak vibratome Chuck temiz kenarlar ve montaj agaroz blok hazırlayın.
Bölüm 3: prosedürü Dilimleme.
- Precooled tampon tepsisi ve soğutma elemanı ayarlayın.
- Yapıştırılmış dokusu ile mandreni takın ve 1x HBSS (Ca 2 +-Mg 2 + ücretsiz HBSS, 10 mM HEPES tamponu pH 7.3, 500 U / ml penisilin / streptomisin) kadar kapalı.
- Yerleştirin ve bir precleaned (70% Etanol) mikrotom bıçak düzeltmek.
- 350 - 450 mikron dilimleri hazırlayın ve onları kısaltılmış cam pasteur pipetler doku kültürü plakaları ile transfer buz üzerinde tutulmalıdır.
- Bir çift forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde her bir dilim ve kültür membranlar Millicell transfer agaroz kaldırmak. Yaklaşık 4 dilim 6 ml kültür ortamı ile dolu bir 10 cm doku kültürü plakası bir membran üzerinde yetiştirilebilir.
- 37 ° dilimleri ° C'de ve% 5 CO 2 (orta Kültür: DMEM,% 25 1x HBSS,% 25 fetal sığır serumu,% 0.5 'lik glukoz, 1mm glutamin, 2.5 mM HEPES, pH 7.3). Bir zaman atlamalı görüntüleme serisi gerçekleştirir ise bir orta hacmi sabit tutmak gerekir. Zamanlı görüntüleme serisinin kısa bir zaman diliminde durumda olduğu gibi, orta bırakmak için yeterli. Uzun kültür dönemleri değişiklikler için 12-20 saat sonra tavsiye edilir.
Bölüm 4: mikroskop Görüntüleme spinal sinir sonucudur.
- Spinal sinirler dik bir floresan mikroskop altında dilimleri, Millicell kültür membranlar içeren, 10 cm doku kültürü plakası yerleştirerek.
- Sonraki görüntüleme süresi noktası sırasında mikroskop sahnede Millicell kültür membranlar yönünü doğru biçimde konumlandırmak için etiketleyin.
- Resim spinal sinir akıbet 4x (sayısal diyafram [NA] 0.1), 10x (NA 0.3), veya 20x (NA 0.5) amaçlar.
Şekil 1, 4x ve 10x hedefleri ile 20 saat boyunca kültür spinal sinir akıbet resmeden bir görüntüleme serisi gösterir.
Şekil 1 Görüntüleme serisi homozigot tauGPF embriyo enine bir dilim spinal sinir akıbet. * = Motor nöronlar ventral omurilik, ok = DRG. Dilim (D) dorsal-ventral (V) eksen gösterilir. Scalebars: 200 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gebeliğin orta fare embriyoları embriyonik dilim kültürleri (E10 - E12) hazırlamak için kapsamlı bir yöntem karşılaştırıldığında, biz bir vibratome soru kültürlerin genel uygulanabilirliği ve tekrarlanabilirliği hem açısından en güvenilir sonuçlar verdiğini gözlemledik sinir akıbet desenler. Buna karşılık, dilimler 3 tamamen inviable olduğunu kanıtladı McIlwain doku kıyıcı kullanılarak hazırlanmıştır. Biz aslında tüm embriyoların bir çöp eş zamanlı seri üretmek için 400 mikron bölüm 1 rendeleyin bir kesim çevresinde sarılmış tungsten teller ile dilimleme tarafından hazırlanan olabilir 4, bir giyotin yöntemi kullandı. Bu teknik hazırlık hız avantajı olmasına rağmen, embriyo başına en az bir canlı bölümünde vermiştir ve büyük miktarda akıbet parametrelerde değişkenlik gösterdi. Bu nedenlerden dolayı, biz vibratome tabanlı bir yöntem hazırlık uzun süre olmasına rağmen üstün bir seçim olduğunu düşünüyoruz. Zorunlu olarak bu çözümün vibratome gerektirmesine rağmen, sonuçlar çok üstün diğer "düşük teknolojili" yaklaşımları yoluyla elde edilmiştir ve bu nedenle yatırım haklı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar fare embriyoları üzerine 5 dilim kültürü gerçekleştirmek için fikir için özgün kaynak kabul ediyorsunuz. Biz çekimler sırasında bizim Gofer olarak hareket etmek için cömert bilimsel destek ve Anna Degen Joachim Kirsch kabul etmek istiyorum. Heidelberg Üniversitesi (Mükemmellik Küme Hücresel Ağlar): Bu çalışma, Alman Araştırma Vakfı (Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9 Deutsche Forschungsgemeinschaft) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS 10x | GIBCO, by Life Technologies | 14180 | |
| Dissection tools | Fine Science Tools | various | |
| L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Whatmann paper | Whatman, GE Healthcare | 3030917 | |
| Shortened firepolished pipettes | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41966 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 10270-106 | |
| Pen Strep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-glutamine 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Vibratome | Microm International | HM 650 V | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
| analySIS | Soft Imaging System | ||
| Millicell-CM inserts | EMD Millipore | PICMORG 50 | |
| 10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | |
| LOCTITE 406 | Henkel Corp | 142580 | |
| Razor blades | Thermo Fisher Scientific, Inc. | none | |
| Dissecting microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| HEPES | Carl Roth Gmbh | 9105.2 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| x4 objective | Olympus Corporation | PL series | |
| x10 objective | Olympus Corporation | UPLFL –PH series | |
| Filter | Olympus Corporation | U-MNIBA2 | |
| CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | |
| Equipment for heated chamber | Leica Microsystems | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |
References
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
- Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).
