Summary
我们现在准备妊娠中期的小鼠胚胎的器官切片周围神经生长的培养和时间推移成像的方法。
Abstract
多种用途，小鼠胚胎体外培养器官切片是可取的。例如，我们采用了转基因小鼠线（tauGFP）在绿色荧光蛋白（EGFP）的增强版本是专门表示，在发展的中枢和外周神经系统1所有神经元的可能性，让这两个电影的支配前肢和操纵这个过程中，药理学和基因工程技术生产的 2 。切片文化的培育成功，最关键的参数，是这片准备的方法。多种方法进行广泛的测试后，我们发现一个vibratome设备切片胚胎等，他们经常在文化，展示了可行性的几天内，最重要的结果是最好的，在这样一个时代的发展特定的方式。对于妊娠中期的胚胎，这包括脊神经从脊髓和背根神经节，他们在外围和适当的骨骼和肌肉组织的决心目标的正常生长。
在这项工作中，我们提出了一种用于加工成300整个胚胎的胚胎一天（五）E10的E12的方法 - 种植400微米片在一个标准的组织文化的孵化器，可研究后切片准备两天。这种方法成功的关键是使用vibratome每个琼脂糖包埋胚胎切片。其次是种植后Millicell小文化膜插入后放在一个中等体积小，接口中的文化技术的切片。凋落物平均7胚胎常规生产，至少有14片（2-3片每胚胎前肢地区），由于胚胎的年龄以及切片厚度略有不同。大约80％的培养切片显示神经生长，它可以测量througout培养期2。使用tauGFP鼠标线的代表结果表明。
Protocol
第1部分：准备切片和培养。
- 切片培养基（DMEM培养液，25％1X HBSS中，25％胎牛血清，0.5％葡萄糖，1毫米谷氨酰胺，2.5毫米的HEPES，pH值7.3）和3厘米Millicell小CM 0.4微米的文化准备10厘米的组织培养板膜插入和孵化器保持在37 ° C和5％的CO 2。
- 在微波炉中加热4％，熔点低，在PBS点琼脂糖，并继续加热板，使其保持在约37 ° C。
- 填补10厘米的细菌培养皿中，用PBS（140毫米氯化钠，氯化钾2.7毫米，10毫米的Na 2 HPO 4，1.8MM KH 2 PO 4），置于冰上。
- 设置切片机的冷却装置，或确保缓冲区托盘和冷却元件在预冷，冷冻储存。
第2部分：嵌入胚胎。
- 解剖胚胎从子宫和审查倒置荧光显微镜检查GFP的表达。
- 在一个倒置的10厘米的培养皿和东方他们胚胎，使用的Whatman纸条，以除去过多的PBS。
- 应用胚胎琼脂糖固定在这个位置上。让琼脂糖巩固。
- 限制的区域，周围用刀片切割胚胎。
- 旋转到另一边嵌入式胚胎。
- 应用胚胎组织的额外琼脂糖，以确保胚胎完全嵌入。
- 准备好干净的边缘和vibratome夹头使用类似“Krazy胶”一个特殊的胶水乐泰406，装载琼脂糖块。
第3部分：切片过程。
- 预冷的缓冲盘和冷却元件。
- 插入粘组织夹头和添加1X的HBSS（ 钙+镁+免费的HBSS，10毫米HEPES缓冲液pH值7.3，500 U / ml青霉素/链霉素），直到覆盖。
- 插入和修复precleaned（70％乙醇）切片机刀片。
- 准备350 - 450微米的薄片，他们转移到组织培养板缩短玻璃巴氏吸管不停地在冰。
- 使用一对镊子，小心地从每个切片和转移到Millicell小文化膜琼脂糖。一个充满了6毫升培养液在10厘米的组织培养板膜，可培养约4片。
- 在37片° C和5％的CO 2（培养基：DMEM培养液，25％1X的HBSS，25％胎牛血清，0.5％葡萄糖，1mm的谷氨酰胺，2.5毫米的HEPES，pH值7.3）。如果一个执行时间推移成像系列，应保持介质的恒定量。在很短的时间内定时成像系列的情况下，它是足够的离开的媒介，因为它是。对于较长的文化时期的变化后12-20小时，建议。
第4部分：在显微镜成像脊髓神经生长。
- 图像放置一个10厘米的组织培养板中，含有一个堂堂正正的荧光显微镜下切片，Millicell小文化膜脊神经。
- 标签的显微镜舞台上的Millicell小文化膜的方向，正确的位置，在未来的成像时间点。
- 图像的脊神经生长使用的4倍（数值孔径NA] 0.1），10X（NA 0.3），或20X（NA 0.5）的目标。
图1显示了成像系列在20小时的文化与4倍和10倍的目标描绘的脊髓神经生长。
图1成像系列在横片tauGPF一个纯合子胚脊髓神经生长。 * =电机的腹侧脊髓，箭头=背根神经节神经元。背片（D）腹（五）轴表示。 Scalebars：200微米。
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Discussion
在比较广泛的方法，准备妊娠中期的小鼠胚胎的胚胎切片文化（E10 - E12），我们观察到一个vibratome毫无疑问，尊重文化的整体可行性和重复性生产的最可靠的结果神经生长模式。相比之下，使用斩波器3被证明是完全inviable一个McIlwain组织切片准备。我们原任一个断头台的方法4，在整个胚胎的垃圾可以同时缠一堑长一连续篦生产400 微米的第1钨丝切片准备。虽然这种技术已经准备速度的优势，取得了最多每一个可行的部分胚胎生长参数显示，大量的变异。基于这些原因，我们认为一个vibratome为基础的方法是上乘之选，尽管在更长的时间准备。虽然这个解决方案必须要求vibratome，结果大大优于已通过其他的“低技术”的办法实现的，因此值得投资。
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Acknowledgments
作者承认的想法执行后，小鼠胚胎5片文化的原始来源。我们要感谢我们gofer在拍摄约阿希姆基尔希的慷慨科学支持和安娜德劲。这项工作是由德国研究基金会（德意志研究联合会：Sonderforschungsbereich 488 Teilprojekt B7/B9）和海德堡大学（卓越集群无线通信网络）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS 10x | GIBCO, by Life Technologies | 14180 | |
| Dissection tools | Fine Science Tools | various | |
| L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Whatmann paper | Whatman, GE Healthcare | 3030917 | |
| Shortened firepolished pipettes | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41966 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 10270-106 | |
| Pen Strep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-glutamine 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Vibratome | Microm International | HM 650 V | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
| analySIS | Soft Imaging System | ||
| Millicell-CM inserts | EMD Millipore | PICMORG 50 | |
| 10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | |
| LOCTITE 406 | Henkel Corp | 142580 | |
| Razor blades | Thermo Fisher Scientific, Inc. | none | |
| Dissecting microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| HEPES | Carl Roth Gmbh | 9105.2 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| x4 objective | Olympus Corporation | PL series | |
| x10 objective | Olympus Corporation | UPLFL –PH series | |
| Filter | Olympus Corporation | U-MNIBA2 | |
| CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | |
| Equipment for heated chamber | Leica Microsystems | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |
References
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
- Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W.
