Summary
طريقة موثوقة ذات كفاءة عالية
Abstract
والتعبير في المختبر وتسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات في خلايا الكلى البشرية المستزرعة الجنينية (كلوة الجنين البشري - 293T) هو استراتيجية للبحث في كل مكان. يجب أن تكون مطلية كلوة الجنين البشري على خلايا - 293T coverslips الزجاج في كثافة منخفضة بما فيه الكفاية بحيث أنها ليست على اتصال مع بعضها البعض من أجل السماح لتسجيل الآثار الكهربية دون التباس بسبب اتصال مع الخلايا المجاورة. ويجب أيضا أن أعرب عن Transfected قنوات ذات كفاءة عالية في غشاء البلازما لخلية كاملة التصحيح تسجيل المشبك التيارات كشف عن مستويات الضوضاء. القنوات الأيونية غيروي غالبا ما تتطلب فترات حضانة طويلة عند 28 درجة مئوية بعد ترنسفكأيشن من أجل تحقيق الكافي التعبير الغشاء ، ولكن هناك زيادة الخسائر في خلية التصاق ساترة والاستقرار في هذا الغشاء درجة الحرارة. للتحايل على هذه المشكلة ، قمنا بتطوير استراتيجية الأمثل لخلايا كلوة الجنين البشري - 293T transfect واللوحة. هذا الأسلوب يتطلب أن تكون الخلايا في transfected confluency مرتفعة نسبيا ، وحضنت في 28 درجة مئوية لفترات متفاوتة الحضانة بعد ترنسفكأيشن كافية للسماح لقناة أيون بروتين تعبير. ومطلي ثم الخلايا Transfected coverslips على الزجاج والمحتضنة في 37 درجة مئوية لعدة ساعات ، والذي يسمح لمرفق خلية جامدة إلى coverslips وrestabilization الغشاء. يمكن تسجيل الخلايا بعد وقت قصير من الطلاء ، أو يمكن نقلها إلى 28 درجة مئوية لمدة حضانة أخرى. نجد أن الاحتضان الأولي في 28 درجة مئوية ، بعد ترنسفكأيشن لكن قبل الطلاء ، هو المفتاح للتعبير عن كفاءة قنوات ايون غيروي التي عادة لا تعبر جيدا في غشاء البلازما. transfected بشكل إيجابي ، ويتم تحديد الخلايا المستنبتة من خلال التعاون مع وأعرب eGFP أو eGFP أعرب من ناقلات bicistronic (على سبيل المثال ، pIRES2 EGFP) يحتوي على قناة أيون المؤتلف [كدنا] المنبع فقط من دخول موقع الريبوسوم الداخلية وتسلسل eGFP الترميز. خلية كاملة تسجيل المشبك التصحيح يتطلب معدات متخصصة ، بالإضافة إلى صياغة من الأقطاب الكهربائية تسجيل المصقول وأقطاب الأرض على شكل حرف L من الزجاج البورسليكات. لا يمكن أن يتحقق تسليم المخدرات لدراسة الصيدلة من القنوات الأيونية التي micropipetting مباشرة المخدرات في صحن التسجيل ، أو باستخدام نظم تدفق microperfusion أو الجاذبية التي تنتج تيارات غير منقطعة من المخدرات على حل الخلايا المسجلة.
Protocol
1. خلية ثقافة
- تزرع الجنينية البشرية الكلى 293T الخلايا (كلوة الجنين البشري - 293T ، Invitrogen) في monolayers ملتصقة في تنفيس قوارير 2 25cm (زراعة الأنسجة المعالجة ؛ Cellstar ؛ غرينر الحيوي واحد) التي تحتوي على 6mL النسور Dulbecco ومتوسطة التعديل (DMEM ؛ سيغما الدريتش) استكملت مع 10 ٪ V / V مصل بقري جنيني (FBS ؛ الدريتش سيغما) ، 1 ٪ البيروفات الصوديوم ، و 250 ميكروغرام / مل البنسلين / الستربتوميسين عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2).
يتم تحضين الخلايا في حاضنات CO 2 (5 ٪ CO 2) تعيين إما إلى 37 درجة مئوية أو 28 درجة مئوية. ويتم العمل مع جميع الخلايا في تدفق الصفحي هود. - وتنقسم الخلايا عادة مرتين في الأسبوع ، من 90 ٪ ~ confluency ، في التخفيف 01:08 يوم الاثنين ويوم الخميس 01:12. (أنظر الشكل 1 لصور كلوة الجنين البشري 293T مطلي الخلايا بكثافات مختلفة)
- لتقسيم ، تتم إزالة وسائل الاعلام من القوارير من الخلايا الطموح ، ويتم فصل الخلايا عن طريق تطبيق الحل 1mL (سيغما الدريتش) التربسين تسخينها إلى 37 درجة مئوية إلى القارورة مقلوب. هو مقلوب لاحقا القارورة وهزت بلطف باليد مثل أن الحل التربسين التحركات على خلايا يعلق عدة مرات. ومن ثم إزالتها بسرعة التربسين التي تطلع و 250 ميكرولتر من التربسين هو micropipetted في القارورة التي هزت مرة أخرى لتحريك الحل التربسين على الخلايا.
- ثم يتم تحضين القوارير في حاضنة CO 2 تعيين إلى 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق ، ويستخدم ماصة لتعليق الخلايا في 4mL الدافئة DMEM تستكمل. سوف trypsinization ناقصة وتسبب تعليق كتل من الخلايا ويمكن أن يسبب الخلايا لتنمو صعودا وليس في المونولاير المقصود. قد الإفراط في trypsinization تلف الخلايا.
- لانقسام 01:08 ، إضافة 500μL الخلايا علقت تضاف إلى قارورة جديدة تحتوي على 5.5mL من DMEM ؛ للانقسام 01:12 (انظر الشكل 1) ، تضاف 333μL الخلايا إلى قارورة جديدة تحتوي على 5.7mL من DMEM . هي مختلطة القوارير بلطف ثم نقل إلى الحاضنة 37 درجة مئوية. خلال 3 - 4H الحضانة عند 37 درجة مئوية بعد انفصالها ، فإن الخلايا الرواسب والتمسك القارورة. الخلايا تبدو في البداية ولكن الجولة سوف تتسطح ولها امتدادات (أقدام كاذبة) مع أكثر حزما المرفق (الشكل 1).
وينبغي أن تنمو الخلايا في المونولاير ملتصقة بطريقة يمكن التنبؤ بها. وينبغي للنمو الخلية ومظهر تكون شاذة أو غير متناسقة ، وتقنية الفقراء أو التلوث (بكتيريا / الميكوبلازما) ينبغي النظر فيها. المفتاح لنجاح زراعة الأنسجة والاتساق.
2. ترنسفكأيشن من كلوة الجنين البشري - 293T مع المؤتلف cDNAs القناة الايونية
- هنا ، يتم استنساخ cDNAs من مختلف القنوات الأيونية في pIRES2 - EGFP البلازميد دينار بحريني (Clontech العلوم البيولوجية) ، والذي يسمح لتحديد الخلايا transfected ايجابيا عبر تعزيز مضان أخضر فلوري (eGFP) البروتين. يتم إنتاج خلايا في eGFP transfected من محضر نفس إدراج استنساخ [كدنا] ، عن طريق الترجمة التي بدأت في الدخول على موقع الريبوسوم الداخلية المصب فقط من المنبع ، وإدراج [كدنا] تسلسل eGFP الترميز (الشكل 2). انظر الشكل رقم 3 لوحات من الفلورسنت كلوة الجنين البشري - 293T ، transfected بإيجابية مع مفارز قناة الكالسيوم في pIRES2 - EGFP يبني.
- قبل ترنسفكأيشن ، يتم تقسيم قارورة متموجة بشكل كامل في 01:04 قارورة جديدة ، ويسمح لخلايا لنعلق على 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 لساعات 3-4 (انظر الشكل 1).
- بعد تولي الخلايا ، يتم استخدام فوسفات الكالسيوم القياسية استراتيجية ترنسفكأيشن (الربيع الباردة هاربور بروتوكولات) لإدخال بنيات تحتوي على القناة الايونية وcDNAs الوحيدات التبعي في الخلايا كلوة الجنين البشري. عادة ، ما مجموعه 12μg من الحمض النووي في 600 ميليلتر من ترنسفكأيشن حل ايسي المستخدمة في قارورة / ترنسفكأيشن.
- بعد pipetted الحل ترنسفكأيشن فوق الخلايا الانقطاع عن الحكمة ، يتم وضع القارورة في الحاضنة 37 درجة مئوية خلال الليل.
- ترنسفكأيشن التالي ، يتم غسلها بعناية الخلايا ثلاث مرات مع وسائل الاعلام دافئ أو الفوسفات مخزنة المالحة (4-5 مل) من قبل pipetting الحل غسل القارورة الى المقلوب ، ثم تحول ببطء القارورة تستقيم وهزاز القارورة بحيث حل غسل التحركات على مدى الخلايا. إذا لم يتم ذلك بعناية يمكن للخلايا detatch وسوف تترك بعد بضعة خطوات غسل الثلاثة. يتم تكرار غسل مرتين أخريين ، ثم تضاف 6 مل من وسائل الإعلام إلى القارورة وحضنت عليه في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ، ثم نقل إلى 28 درجة مئوية الحاضنة.
- ويمكن التأكد من نجاح ترنسفكأيشن pIRES2 - EGFP يبني 1 إلى 3 أيام بعد ترنسفكأيشن باستخدام المجهر epifluorescence. والخلايا التي يتألق خضراء عند تعرضها للأشعة فوق البنفسجية بشكل إيجابي ، وينبغي أن يعبر عن transfected قناة أيون غيروي eGFP والبروتينات.
3. الطلاء transfected الخلايا HEK293T استعدادا لتسجيل الكهربية
NT "> ايون مختلفة عن القنوات مع كفاءات مختلفة في غشاء خلية من خلايا كلوة الجنين البشري ، وعلى هذا النحو ، فإن ما تبقى من هذا البروتوكول يتطلب بعض التحسين لتحقيق أقصى قدر من قناة التعبير سطح السماح لتسجيل الكهربية ناجحة. قنوات التعبير في خلايا أيون غيروي كلوة الجنين البشري ، ولا سيما تلك الواردة من المنظمات غير الثدييات المصادر ، قد ينطوي على بعض التحديات بما في ذلك (1) أحجام كبيرة من البروتين تتطلب فترات طويلة لترجمة وتعريب لغشاء البلازما (2) غياب أو الفروق للطي واستهداف عناصر زخرفية على البروتين قناة ضرورية في الثدييات خط الخلية (3) يمكن أن الاختلافات في استخدام الترددات كودون من نوع إلى نوع ، كل هذه العوامل مجتمعة تؤدي إلى شرط لأوقات طويلة في الحضانة 28 درجة مئوية ، مما يضمن فعالية بروتين تعبير والتوطين السطح دون انقسام الخلايا (التي من شأنها أن تخفف من وcDNAs غيروي والبروتينات) ، وللأسف ، الحضانة لفترات طويلة عند 28 درجة مئوية يؤدي إلى انفصال الخلايا والفقراء الاستقرار صنع غشاء تسجيل الكهربية صعبة. قررنا تعديل استراتيجيات ترنسفكأيشن التقليدية (التي استعرضت في توماس والذكية 2005) من أجل تقليل الحضانة في 28 درجة مئوية قبل التسجيل والتعبير إلى أقصى حد السطح. الأسلوب يتطلب أن يكون لدينا transfected الخلايا ، حضنت لمدة 3-7 أيام عند 28 درجة مئوية ، ثم يتم فصل الخلايا عن طريق trypsinization وreplated على coverslips والمحتضنة في 37 ° C التي restabilizes الأغشية ويسمح بارتباط قوي من الخلايا على coverslips. الخلايا هي قادرة على أن تكون ثم تسجيلها على الفور ، أو يمكن المحتضنة لفترات إضافية من الوقت حتى 28 درجة مئوية ونحن نجد أن replating من الخلايا على coverslips في هذه المرحلة في وقت لاحق في اسلوبنا على أنها ضرورية للغاية لإنتاج أعداد كبيرة coverslips مع قناة للتعبير ، وخلايا مرفقة منفصلة.نقدم البديل استراتيجيتين ، واحدة أن نفضل استخدام القنوات الأيونية والمجمعات القناة الايونية التي لا تحتوي على مجالات خارج الخلية الكبيرة التي قد تكون عرضة لعملية الهضم التربسين (مثل Cav3 قنوات الكالسيوم الجهد مسور ؛ SENATORE وسبافورد 2010) ، واحد التي نستخدمها لقنوات ايون التي لا تحتوي على مجالات خارج الخلية الكبيرة (مثل نوع L - قنوات الكالسيوم الجهد بوابات ومفارز من الإكسسوارات الخاصة بهم ؛ SENATORE ، وآخرون 2010).
- يتم تحضين الخلايا عند 28 درجة مئوية لمدة 2-6 أيام لمنع انقسام الخلايا ، والسماح لتراكم البروتين ترجمتها. يجب تحديد هذا الوقت حضانة تجريبيا لكل قناة أيون ، منذ سطح التعبير يعتمد على العوامل الجوهرية التي تملي كيفية مرنا القنوات "الوليدة ومتواليات ببتيد بالتفاعل مع الآلات ومتعدية المسار إفرازية ، على التوالي.
- قبل الطلاء ، coverslips الزجاج الدائرية (دوائر رقم 1 -- 0.13 و 0.17mm سميكة ؛ الحجم : 12 ملم ، وفيشر العلمية كندا ، أوتاوا ، أونتاريو) هي المغلفة مع بولي - L - يسين (سيغما) كما في لتعليمات الشركة الصانعة.
- تتم إزالة وسائل الإعلام التي تطلع من خلايا transfected ، و 1 مل من 37 درجة مئوية هو micropipetted التربسين الحل (سيغما) إلى القارورة المقلوب (الجانب خلية متابعة). ومن ثم القارورة مقلوب برفق لموقف تستقيم للسماح للالتربسين لتشغيل أكثر من الخلايا ، ومن ثم إعادة القارورة مقلوب ، والتربسين تحذف من قبل الطموح. ثم يتم إضافة 250 ميكرولتر من التربسين الدافئ مباشرة على الخلايا والمحتضنة القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق حتى detatch الخلايا.
- وفي الوقت نفسه ، يتم وضعها بولي - L - يسين المغلفة coverslips إلى أطباق ثقافة 6mm (3-8 في الطبق) ويضاف 5 مل من وسائل الإعلام ثقافة الحارة إلى كل طبق.
- ومعلق الخلايا Trypsinized 4mL مع وسائل الإعلام الثقافة حارا من قبل pipetting صعودا وهبوطا ~ 6 مرات ، ثم يتم micropipetted 250 500μL معلق من الخلايا في الأطباق التي تحتوي على الثقافة coverslips. قبل إضافة الخلايا ، يتم استخدام غيض من micropipette لدفع حملة على coverslips للتأكد من أنها تقع في الجزء السفلي من الطبق.
- ثم يتم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 3hrs لتمكينها من الانضمام إلى coverslips ، ومن ثم يتم نقلهم إلى 28 درجة مئوية. عند هذه النقطة ، فإن الخلايا على استعداد لتسجيل الكهربية ، والتي تتم بشكل مثالي مع منفصلة المرفقة الخلايا (خلايا Fig.3 يوضح transfected قبل وبعد الطلاء على coverslips). ترك الخلايا لفترة طويلة جدا على 37 درجة مئوية وسوف يؤدي إلى انقسام الخلية.
- ويتم إعداد الخلايا معربا عن قنوات / مجمعات القناة مع مجالات واسعة خارج الخلية في الكثير بنفس الطريقة كما هو مبين أعلاه ، مع الاستثناء الذي يتم تحضين coverslips على 28 درجة مئوية ويتم لأيام إضافية 2-4 قبل ان يسجل الكهربية بها. وهذا يسمح لتراكم إعادة قنوات / قناة جomplexes في غشاء الخلية بعد trypsinization.
4. الكهربية تسجيل قنوات المؤتلف في كلوة الجنين البشري - 293T الخلايا
الموارد بصورة شاملة تتوفر العديد من المفاهيم التي تصف العامة التي يقوم عليها تسجيل الكهربية (مثل أوغدن وStanfield 1987 ؛ Molleman 2003).
4.1 الكهربية تلاعب
نموذجي تلاعب الكهربية (الشكل 4) يتضمن مكبر للصوت (على سبيل المثال أو Axopatch 200B 700B Multiclamp مكبر للصوت ؛ آلات أكسون والاتحاد سيتي ، كاليفورنيا) ، وجهاز كمبيوتر PC مجهزة واجهة 1440A Digidata تحويل التناظرية إلى الرقمية بالتعاون مع pClamp10.1 برنامج (الأجهزة الجزيئية ، سانيفيل كاليفورنيا) ، الميكانيكي ، والمتلاعبين ماصة المزدوج (MPC - 385 - 2 ، سوتر شركة الصك) ، مجهرا epifluorescence (40 Axiovert CFL ، زايس كندا ، تورنتو ، اونتاريو) ونظم الارواء (الأرقام 4 و 5 ). الاهتزازات التي تقتصر تركيب المعدات على طاولة TMC سلسلة 63-500 العزلة الاهتزاز (فني شركة التصنيع ، بيبودي. MA). يقتصر الضجيج الكهربائي الضالة باستخدام 40 "طويل القامة النوع الثاني قفص فارادي (TMC) المحيطة المعدات الكهربائية التي شنت على طاولة الاهتزاز العزلة. أنظمة التحكم الإلكترونية (مثل الكمبيوتر وجهاز العرض ، مكبر للصوت ، تحويل التناظرية إلى الرقمية ، وتتلاعب بمحركات هي التي شنت Valvelink نظام مراقبة نضح) من خارج قفص فاراداي إلى رفوف معدنية قائمة بذاتها الكهربائية (هاموند التصنيع ، غيلف أونتاريو). يرتكز جميع المعدات الكهربائية لموزع النحاس وموصول Tranformer الصف عزل الطبية (1800W ، تريب لايت UL60601 - 1) التي تنص على عزل الخط ، أرضية ثابتة وتصاعد القمع.
ماصات تصحيح 4.2
وخفضت الى النصف وإدراجه ضمن يلهب / براون Micropipette بولير النموذجي P - 97 (سوتر شركة الصك) أنابيب الزجاج البورسليكات الشعرية مع خيوط (سوتر شركة آلات OD 1.5mm ، OD 0.86mm طول 15cm ؛ ؛ BF150 - 86 - 15) . تم تحسين برنامج ماصة ، مجتذب لتوليد باستمرار مع ماصات المقاومات بين 2 إلى 5MΩ من القطب إلى الأرض (بعد تلميع النار ؛ Fig.6) الماصات ومصقول النار بشكل فردي لضمان سلاسة السطوح غيض ماصة الذي يسمح للأختام مشددة ضد أغشية الخلية ( قهوة الدقيقة MF - 830 ؛ Narishige ، اليابان ؛ الشكل 6). هي التي شنت على Micropipettes headstage مع حامل المتخصصة (1 - HL - U ؛ الأجهزة الجزيئية ، سانيفيل كاليفورنيا).
أقطاب الأرضي 4.3
كما تستخدم أنابيب الزجاج البورسليكات التي استخدمت لصنع ماصات التصحيح لجعل أقطاب المرجعية. يتم قطع الأنابيب 15cm طويلة الى 3 قطع. ملقط مع غرامة ذات الرؤوس 2 ، يتم عقد الأنابيب في بنسن لهب الموقد حتى يصبح زجاج مرن ، ويمكن أن تكون عازمة على أنابيب إلى "L" أو "عصا الهوكي" الشكل بزاوية 90o. في حين أن الأنابيب الزجاجية لا تزال ساخنة ، وعلى الفور منغمسين في نهاية واحدة CSCL 3M الساخنة ، و 1.5 ٪ agarose الحل الذي يتم رسمها في أنبوب من خلال العمل الشعري. حالما يتم ملؤها تماما مع القطب مرجعية الحل ، يتم وضعها في كوب من الماء البارد. بعد أن يتم شغل كل من أقطاب المرجعية ، ومسحت بشكل فردي مع أنها Kimwipes لإزالة agarose اضافية من الخارج والغارقة في حل CSCL 3M. لتسجيل الكهربية ، وتعقد الأقطاب مرجع في هولدر Microelectrode نصف خلايا (حامل 90 F بيليه 1.5mm ؛ # MEH3RF15 ؛ العالم آلات دقيقة ، وشركة ساراسوتا فلوريدا) مملوءة بمحلول CSCL 3M. (انظر الشكل 7 التوضيح من الارض في القطب حل حمام)
4.4 الحلول الكهربية تسجيل
أنواع مختلفة من القنوات ايون الجهد بوابات تسجيل تتطلب حلولا مختلفة اعتمادا على نفاذية أيون / الانتقائية. لقنوات الكالسيوم الجهد مسور ، واستحم عادة في الخلايا التي تحتوي على الحلول الخارجية إما الباريوم أو الكالسيوم بتركيزات مختلفة. على سبيل المثال ، يمكن إجراء تسجيل الكهربية من اللافقاريات Cav3 قناة الكالسيوم الجهد بوابات (LCav3) باستخدام حلا الخارجية التي تحتوي على 5mM CaCl 2 ، 166mM رباعي إيثيل الأمونيوم (TEA - CL) ، HEPES 10MM مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 - OH مع الشاي. تمتلئ ماصات التصحيح مع حل داخلي للCSCL 125mM ، EGTA 10MM ، 2mm وCaCl 2 ، 1MM MgCl 2 ، MgATP 4mM ، 0.3mM تريس - GTP ، وHEPES 10MM مع الرقم الهيدروجيني من 7.2 (SENATORE وسبافورد ، 2010). ويمكن تسجيل اللافقارية نوع L - قناة الكالسيوم الجهد بوابات (LCav1) باستخدام حلا الخارجية التي تحتوي على الباريوم باعتبارها الناقل مسؤولا (15mM BaCl2 ، 1MM MgCl 2 ، HEPES 10MM ، 40mM الشاي CL ، 72.5mM CSCL ، 10MM الجلوكوز ، مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 مع OH - TEA) ، وتحتوي على حل داخلي 108mM CS - methanesulfonate ، 4mM MgCl 2 ، 9MM EGTA ، HEPES 9MM ، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.2 مع CsOH (SENATORE وآخرون. ، 2010).
4.5 تسجيل خلية كاملة
- يتم نقل ساترة تحتوي على خلايا transfected (التعبير عن القنوات الأيونية مغاير أو المجمعات قناة أيون) على طبق من البلاستيك تحتوي على بتري 35mm ~ 3mL حل تسجيل خارجي. يجب أن يكون قياس حجم حل تسجيل بدقة عند تنفيذ التجارب المخدرات حيث كميات معروفة من المخدرات التي يمكن ان تضاف الى الطبق مع micropipette. تتم عادة التسجيلات الكهربية في درجة حرارة الغرفة ، على الرغم من أن الباحث قد ترغب في تغيير هذه الحرارة اعتمادا على التجربة.
- الخلايا هي تصور من خلال مجهر epifluorescence ومعزولة ، بشكل إيجابي ، transfected ، ويتركز في الخلايا الخضراء ملتصقة منتصف مجال الرؤية.
- وخفضت ماصة التصحيح في حل حمام باستخدام micromanipulator ، الذي يكمل الدائرة بين القطب في ماصة التصحيح والقطب المرجع. بينما في وضع الحمام ، برنامج pClamp10.1 أسباب مكبر للصوت لتوليد التيار الكهربائي تكرار الخطوات الصغيرة بين ماصة والقطب المرجعية ، ويعرض الحالية الناتجة كما تتبع الموجة مربعة الشكل (8A). يجب أن تتبع هذا ركزت الموجة مربع باستخدام ماصة تعويض على مكبر للصوت قبل التصحيح خلية. ويتم قياس المقاومة ماصة بواسطة برنامج pClamp10.1 ، وينبغي أن يكون ضمن 5MΩ - 2.
- بينما في وضع الحمام ، يتم جلب ماصة الى مقربة من الخلية ، والذي يمكن تصوره على التقلبات السريعة في تتبع موجة مربع ، ثم يتم تطبيق كمية ضئيلة من الشفط إلى ماصة التصحيح على شكل خاتم gigaohm بين وماصة الغشاء (الأسباب كاملة مسطحة خط تتبع موجة مربعة ؛ 8B الشكل).
- ثم يتم تشغيل البرنامج لوضع التصحيح ، وماصة السعة (مرئية والتغيرات الصغيرة الصغيرة الحالية على حواف الرائدة وزائدة من تتبع الحالية مسطحة ؛ 8B الشكل) يتم تعويض مع التعويض السعة ماصة على مكبر للصوت.
- ويطبق ولكن كمية صغيرة حادة من الشفط لتمزق الغشاء في التصحيح ، والسماح للوصول من القطب إلى داخل الخلية. يشار إلى تمزق غشاء ناجحة من مظهر العابرين بالسعة الكبيرة أيضا على قيادة وحواف زائدة تتبع الموجة الحالية (8C الشكل). يتم ضبط كسر مرة واحدة من خلال تم تحقيقه ، هو تحول البرنامج إلى وضع الخلايا وتعويض كامل قدرة الخلايا على مكبر للصوت لإزالة العابرين بالسعة. هناك تأخير لبضع دقائق للسماح للموازنة من الحل تسجيل الخلايا في الخلية قبل التسجيل.
- يتم إنشاؤها أوامر الجهد والحصول على البيانات باستخدام جهاز كمبيوتر مجهزة واجهة 1440A Digidata تحويل التناظرية إلى الرقمية بالتعاون مع pClamp10.1 البرمجيات. بروتوكولات مكتوبة فريدة المشبك الجهد لكل تجربة ، وتستخدم هذه التيارات لتسجيل القناة الايونية من خلايا transfected. يوضح الشكل 9 التيارات الكالسيوم المسجلة من خلية كلوة الجنين البشري - 293T معربا عن اللافقارية LCav3 قناة الكالسيوم الجهد مسور. عقدت خلية في الجهد - 110mV ، وأخذت depolarisations المتزايد بين 70mV ، وبالسيارات +20 التيارات لانتزاع الكالسيوم الداخل.
- يتم تصفية التيارات المسجلة في 10 كيلو هرتز باستخدام المنخفضة تمرير بسل تصفية ورقمية على تردد أخذ العينات من 2 كيلو هرتز. وتستخدم تسجيلات فقط مع الحد الأدنى من تسرب (<10 ٪) للتحليل ، ويتم حاليا طرح تسرب خارج باستخدام Clampfit 10.1 البرنامج.
دراسات المخدرات سجلت 4.6 من الخلايا
قد تكون الأدوية pipetted مباشرة في طبق يتم تسجيلها. ويمكن احتساب نسبة تركيز للمخدرات وإذا كان حجم المخدرات واضاف من المعروف حجم حل الحمام. ويمكن أيضا كميات محدودة من تكلفة أو المخدرات التي تضاف microperfusion من مشعب متعددة برميل بوليميد قلم نضح مع طرف ميكرون 250 القابلة للإزالة ، وذلك باستخدام إما قناة Smartsquirt الضغط الجزئي eight نظام الارواء (أتمتة العلمية) أو الجاذبية تعمل من خلال نظام تدفق الصمامات تفلون وصمام تحكم Valvelink8 (أتمتة العلم ، وانظر الشكل رقم 5 لنظام الاجهزة التروية). يتم تعيين معدلات تدفق من أنظمة microperfusion 0.1mL في الدقيقة الواحدة في دفق قلم الخروج من نضح 400 ميكرون من الخلية مسجل. وينبغي أن المسافة من رأس القلم الرصاص نضح من تسجيل غيض من القطب تكون متسقة التصحيح إلى التصحيح ، ويوضح الشكل 10 واقترح على مسافة مرئية في التكبير 40X. معدلات التدفق الكافي توفير نضح تشبع من الخلية مسجل. قبل إجراء التجربة باستخدام microperfusion المخدرات ، وخلايا ومعايرتها مع microperfusion حمام من محلول التحكم في دفق مستمر. يتم تجنب انقطاع الحد الأدنى للتيار خلال التجربة عن طريق التحول السريع من حمام السيطرة ، أو تعاطي المخدرات أو محلول الغسيل. ويمكن استخدام الشفط شنت على حافة الطبق تسجيل طنس إزالة الفائض من الحلول ، عن طريق الشفط اليدوي مع حقنة أو باستخدام جهاز مضخة تمعجية مدفوعة (مثل مضخة MINISTAR مصغرة تحوي العاصمة ، الآلات الدقيقة الدولي). يجب توخي الحذر منذ نضح السريع للغاية يدفع قوى القص الذي قد يغير التيار الكالسيوم (بنغ وآخرون 2005) ، قد يجرف الخلية يتم تسجيلها ، ويستنزف مخزون الدواء بسرعة كبيرة جدا.
pipeting مباشرة في مقابل طبق نظم الارواء
| المباشرة pipetting | النظام الجزئي الإرواء | نظام الجاذبية تدفق نضح | |
| حجم المخدرات المطلوبة | معتدل | منخفض | ارتفاع |
| المهارات التقنية | منخفض | متوسط | متوسط |
| تكلفة المعدات | منخفض | هام | هام |
| صحيفة الوقت لإعداد وتنظيف | لا شيء | 20 + دقائق | 20 + دقائق |
| تلوث المعدات | لا شيء | نعم | نعم |
| المشاكل | سهل | معقد | معقد |
| مضمون المخدرات في صحن | نعم | لا | لا |
| تفقد الخلية مع إدمان المخدرات | نعم | نعم | نعم |
| يقلل كثيرا اضرب المخدرات. عن طريق الغسيل | صعب | صريح | صريح |
| سهولة القيام متعددة منحنى الاستجابة للجرعة | أقل من المستوى الأمثل | صريح | صريح |
| استنساخ النتائج | OK -- اعتمادا على موقع pippeting | جيد | جيد |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أن تكون قادرة على تسجيل كامل الخلية التيارات باستخدام البروتوكولات وصفها والحلول يشير إلى أن ترنسفكأيشن كانت ناجحة وأن المطلوب قنوات ايون الجهد أو بوابات المجمعات قناة ايون موجودة بكميات كبيرة في غشاء الخلية. وينبغي transfected الخلايا بشكل إيجابي (أي الفلورية الخضراء) ولكن لم يكن لديك التيارات للتسجيل ، وقتا إضافيا في 28 درجة مئوية قد تكون هناك حاجة للسماح للقناة أن يكون البروتين تعبئتها بشكل سليم وإدراجها في غشاء الخلية. علما بأن الحضانة لفترات طويلة عند 28 درجة مئوية يؤدي إلى فصل الخلايا من coverslips ، والأغشية زعزعة الاستقرار وتتراكم الخلايا الميتة من الحطام ، مما يجعل التصحيح تسجيل المشبك أكثر تحديا. وقد تم تحسين جميع الأوقات واقترح في هذا البروتوكول لقنواتنا الخاصة. قد قنوات أخرى ووحداتها الفرعية تتطلب مرات حضانة أطول أو أقصر ، ويمكن تعديلها لدينا مزيد من البروتوكول حسب الحاجة. لقنوات معينة فقيرة الكفاءة ترنسفكأيشن (خلايا أي أقل كثافة أقل الفلورسنت ومضان في الخلية) تنتج نتائج أفضل من الخلايا ، transfected بكفاءة عالية الفلورسنت. وينبغي أن تكون الخلايا الفلورسنت ولكن لم يكن لديك للتسجيل التيارات ، ونقاط للنظر في المشاكل ما يلي : نقص البروتين الملحق (ق) ؛ غير لائق خلط الكواشف ترنسفكأيشن ؛ حلول تسجيل دون المستوى الأمثل ، والطفرة / إعادة التركيب من القناة أو القنوات الوحيدات المنتجة غير صحيح يبني [كدنا] مطوية أو عدم التعبير عن القنوات.
تزرع الكلى البشرية الجنينية 293T الخلايا (كلوة الجنين البشري - 293T) في monolayers ملتصقة في 37oC في حاضنات CO2 (CO2 5 ٪) في قوارير 25cm2 تنفيس إلى 90 ٪ confluency وانقسام في 1:12 ، 1:08 و 1:04 : الشكل 1 التخفيفات. وتنقسم الخلايا عادة مرتين في الأسبوع ، من confluency ~ 90 ٪. لضمان مماثلة ~ 90 ٪ confluency في تقسيم ، وتنقسم الخلايا في التخفيف 01:08 يوم الاثنين ويوم الخميس 01:12. قبل ترنسفكأيشن ، يتم تقسيم قارورة متموجة بشكل كامل في 01:04 قارورة جديدة ، ويسمح لخلايا لنعلق على 37oC في حاضنة CO2 لساعات 3-4.
الشكل 2 : استراتيجية مغايرة للتعبير من القنوات الأيونية في كلوة الجنين البشري - 293T (يسار) والمستنسخة cDNAs قناة ايون في موقع استنساخ متعددة من EGFP - pIRES2 البلازميد. (الحق) ترنسفكأيشن هذه الخلايا إلى نتائج يبني كلوة الجنين البشري في إنتاج جزيئات مرنا يحتوي على القناة الايونية تسلسل الترميز (الأحمر) فقط المنبع لموقع الريبوسوم دخول الداخلي (IRES ؛ الأزرق) وتسلسل eGFP الترميز (الخضراء). وتترجم القنوات الأيونية وتنقل إلى غشاء الخلية عبر لائحة ونظام endomembrane ، في حين تترجم eGFP والاحتفاظ بها في السيتوبلازم.
الشكل 3 : ترنسفكأيشن والتعبير عن غيروي cDNAs القناة الايونية في كلوة الجنين البشري - 293T الخلايا ، والطلاء من الخلايا على coverslips لتسجيل الكهربية (A) (لوحات الأعلى) كلوة الجنين البشري - 293T الخلايا المحتضنة في 28 م ، بعد أربعة أيام مع ترنسفكأيشن قنوات الكالسيوم LCav3 آوى في pIRES2 - EGFP الثدييات ناقلات التعبير CMV. (لوحات القاع) والخلايا أعلاه trypsinized ومطلي coverslips على الزجاج ، وعزل لتسجيل الكهربية. التفاضلية المجهري التباين التدخل (DIC).
الشكل 4 : نموذجي تلاعب في تسجيل الكهربية الإعداد المكونات الكهربية تلاعب في تسجيل تشتمل على مكبر للصوت (A) ، وجهاز كمبيوتر شخصي (PC) ، Digidata 1440A تحويل واجهة التناظرية إلى رقمية (C) ، الميكانيكي ، والمتلاعبين ماصة المزدوج (بعد الظهر) ، مجهر epifluorescence (M) ، ونظم الارواء (P) ، TMC الاهتزاز سلسلة 63-500 الجدول العزلة (VT) ، 40 طويل القامة النوع الثاني قفص فارادي (FC) ، وقائمة بذاتها المعادن 19 ، رف الكهربائية (R).
الشكل 5 : نظم الإرواء (أ) نظام تدفق الجاذبية تعمل باستخدام الصمامات وأجهزة التحكم Valvelink8 التفلون. (ب) ثمانية الضغط Smartsquirt قناة الدقيقة نظام الارواء. هي التي شنت متعددة برميل تلميح المنوع إما نظام نضح على تتلاعب بمحركات.
وقد تولدت ملمع ماصات التصحيح ، كما هو موضح في التكبير (يمين) 10X (يسار) وتصحيح 40X من ماصات أنابيب زجاجية البورسليكات الشعرية مع خيوط النار ومصقول لضمان سلاسة السطوح غيض ماصة : الرقم 6. وكان برنامج الأمثل ماصة ، مجتذب لتوليد ماصات التي أعطت قراءة 5MΩ - 2 في الكهربية لدينا مجموعة المتابعة.
2314fig7.jpg "بديل =" الرقم 7 "/>
الشكل 7 : القطب الأرضي وماصات التصحيح في صحن تسجيل تصحيح ماصة (يمين) والقطب الأرض (يسار ؛ السهم الأبيض) في محلول التسجيل.
الشكل 8 : لقطات الشاشة pClamp10.1 توضح الخطوات لجعل التصحيح (أ) : لاحظ ساحة تتبع الموجة عندما تكون في وضع الحمام. (ب) في وضع الختم Gigaohm التصحيح يؤدي إلى تسطيح تتبع موجة مربع مع السعة ماصة مرئية كما ضئيلة من التغيرات الصغيرة الحالية على حواف الرائدة وزائدة من تتبع الحالية مسطحة. (C) بعد انفراج في الوضع وعلى الرغم من الخلية ، وينظر العابرين بالسعة الكبيرة.
الرقم 9 : نتائج الكهربية (يسار) للتسجيل الداخل التيارات الكالسيوم الجهد بوابات يشير ترنسفكأيشن ناجحة والتعبير من القنوات ايون مغاير (مثل LCav3). (الحق) ليس لديهم خلايا Untransfected التيارات للتسجيل. وتعرض الخلايا لبروتوكول الرابع التي تنص على أن البرنامج يعقد في الخلية ، ثم 110mV خطوة إلى 70mV ل250msec ثم يتراجع إلى 110mV عقد محتمل. في كل مرة خطوة بمقدار 10mV بحيث تكون الخطوات إلى 70mV الخ ، - 60mV حتى الخطوة الأخيرة هي ل+20 بالسيارات. النتائج هي لاللافقارية T - نوع (Cav3) الجهد بوابات الكالسيوم من القناة نديد الراكدة لام وصف LCav3.
الرقم 10 : الترتيب من الأقطاب الكهربائية وقلم رصاص في حل microperfusion تسجيل (A) ماصات تصحيح المصنوعة من الزجاج البورسليكات (يمين) وبوليميد متعددة برميل المتعددة الطرف لنضح المخدرات (يسار). عازمة القطب الأرض (الظهر) من الزجاج البورسليكات مليئة CSCL 3M ، و 1.5 ٪ كما حل agarose عصا الهوكي الذي عقد في هولدر Microelectrode نصف خلايا. (ب) عرض 40X من خلال المجهر من نضح رأس القلم الرصاص وmicroelectrode التسجيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال اكتشاف المنحة التشغيل إلى JDS من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث (NSERC) في كندا ، والكسندر غراهام بيل كندا NSERC منح دراسات عليا (دكتوراه) (ألف لSENATORE) ومؤسسة القلب والسكتة الدماغية ، منحة على سبيل المعونة NA # 6284.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech Laboratories | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 - 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Micr–lectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments, Inc. | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige International | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).
- Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
