Summary
Método fiable para alta eficiencia
Abstract
La expresión in vitro y de registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes dependientes de voltaje en cultivos de células de riñón embrionario humano (HEK-293T) es una estrategia de investigación en todas partes. HEK-293T las células deben ser sembradas en cubreobjetos de vidrio con una densidad lo suficientemente baja para que no estén en contacto unos con otros con el fin de permitir registro electrofisiológico, sin factores de confusión debido al contacto con las células adyacentes. Canales transfectadas también debe expresarse con la máxima eficiencia en la membrana plasmática de células enteras de grabación de patch clamp de las corrientes detectables por encima de los niveles de ruido. Canales de iones heteróloga a menudo requieren largos períodos de incubación a 28 ° C después de la transfección con el fin de lograr la adecuada expresión en la membrana, pero cada vez hay más pérdidas de adhesión célula-cubreobjetos y estabilidad de la membrana a esta temperatura. Para evitar este problema, hemos desarrollado una estrategia optimizada para transfectar y la placa de HEK-293T las células. Este método requiere que las células se transfectaron en una confluencia relativamente alto, y se incuba a 28 ° C durante diferentes períodos de incubación después de la transfección para permitir la expresión de la proteína adecuada de los canales iónicos. Células transfectadas se está chapada en cubreobjetos de vidrio y se incuba a 37 ° C durante varias horas, lo que permite la adhesión celular rígido para los cubreobjetos y re-estabilización de la membrana. Las células se pueden grabar poco después de la siembra, o pueden ser transferidos a 28 ° C de incubación. Nos encontramos con que la incubación inicial a 28 ° C, después de la transfección de las placas, pero, es la clave para la expresión eficaz de los canales iónicos heteróloga que normalmente no se expresan así en la membrana plasmática. Positivamente transfectadas, las células cultivadas se identifican por co-expresó eGFP o eGFP expresa a partir de un vector bicistrónico (por ejemplo, pIRES2-EGFP) que contiene el canal de iones cDNA recombinante justo aguas arriba de un sitio interno de entrada de ribosomas y una secuencia de codificación eGFP. De células enteras de grabación de patch clamp requiere equipo especializado, además de la elaboración de electrodos de registro y pulido en forma de L electrodos de masa de vidrio de borosilicato. La administración de fármacos para el estudio de la farmacología de los canales iónicos se puede conseguir directamente micropipetting drogas en el plato de grabación, o mediante el uso de microperfusión o sistemas de desagüe que producen flujos ininterrumpidos de solución del fármaco sobre las células registrado.
Protocol
1. Cultivo de células
- De riñón embrionario humano células 293T (HEK-293T, Invitrogen) se cultivan en monocapas adherentes en ventilados 25 cm 2 frascos (cultivo de tejidos tratados, Cellstar, Greiner Bio-One), que contiene 6 ml de Dulbecco modificado Eagles Medium (DMEM, Sigma Aldrich), complementado con 10 % v / v de suero fetal bovino (SFB, Sigma Aldrich), 1% de piruvato de sodio y 250 mg / ml de penicilina / estreptomicina a 37 ° C con 5% de CO 2).
Las células se incubaron en incubadoras de CO 2 (5% CO 2) establece en 37 ° C o 28 ° C. Todo el trabajo con las células se realiza en una campana de flujo laminar. - Las células suelen dividir dos veces por semana, de ~ 90% de confluencia, en una dilución 1:08 los lunes, y 01:12 los jueves. (Ver Figura 1 para las imágenes de HEK-293T células sembradas en diferentes densidades)
- Para la división, los medios de comunicación se retira de los frascos de las células mediante aspiración, y las células se separan mediante la aplicación de 1 ml de tripsina (Sigma Aldrich) la solución se calienta a 37 ° C en el matraz invertido. El frasco es invertida y posteriormente se balanceaba suavemente con la mano de tal manera que la solución de tripsina se mueve sobre las células adjunto en varias ocasiones. La tripsina es rápidamente eliminado por aspiración y 250 l de tripsina se micropipetted en el matraz que se sacudió una vez más para mover la solución de tripsina en las células.
- Frascos se incuban en una incubadora de CO 2 fijado a 37 ° C durante 3-5 minutos, y una pipeta se utiliza para suspender las células en 4 ml de agua tibia complementado DMEM. Tripsinización incompleta y la suspensión causará grupos de células y puede causar que las células crezcan hacia arriba y no en la monocapa previsto. El exceso de tripsina puede dañar las células.
- Por una fracción de 1:8, añadir 500μL de células en suspensión se suman a un nuevo frasco que contiene 5.5ml de DMEM, por una fracción de 1:12 (ver Figura 1), 333μL de las células se añaden a un nuevo frasco conteniendo 5.7mL de DMEM . Frascos se mezcla suavemente luego fue trasladado a una incubadora a 37 ° C. Durante la incubación de 3-4h a 37 ° C después de la división, las células de sedimento y se adhieren a la botella. Las células inicialmente mirar a su alrededor, pero se aplanan y tienen extensiones (pseudópodos) con firme apego (Figura 1).
Las células deben crecer en una monocapa adherente de una manera predecible. Si el crecimiento celular y la apariencia sea atípico o inconsistente, una mala técnica o la contaminación (bacterias / micoplasma) debe ser considerado. La clave para el éxito del cultivo de tejidos es la consistencia.
2. La transfección de células HEK-293T con recombinante ADNc de canales de iones
- Aquí, ADNc de varios canales de iones son clonados en el plásmido pIRES2-EGFP (BD Biosciences Clontech), que permite la identificación de las células transfectadas positivamente a través de una mayor proteína verde fluorescente (EGFP) de fluorescencia. El eGFP se produce en las células transfectadas de la transcripción del mismo que el inserto clonado de cDNA, mediante la traducción iniciada en un sitio interno de entrada de ribosomas justo aguas abajo del inserto de ADNc y arriba de la secuencia de codificación eGFP (Figura 2). Ver Figura 3 para imágenes de fluorescencia HEK-293T, positivamente transfectadas con subunidades de los canales de calcio en pIRES2-EGFP construcciones.
- Antes de la transfección, un frasco totalmente confluente es división de 1:4 en un nuevo frasco, y las células que se pueden conectar a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 3-4 horas (ver Figura 1).
- Después las células se unen, un fosfato de calcio estándar de la estrategia de la transfección (Cold Spring Harbor protocolos) se utiliza para introducir construcciones que contengan los canales iónicos y de ADNc accesorio subunidad dentro de las células HEK. Por lo general, un total de 12μg de DNA en 600 l de solución de transfección ise utilizados por frasco / transfección.
- Después de la solución de transfección es una pipeta sobre las células sabio de abandono, el frasco es colocado en una incubadora a 37 ° C durante la noche.
- Transfección siguiente, las células son cuidadosamente lavadas tres veces con los medios de comunicación tibia o tampón fosfato salino (4-5 ml) al vaso de la solución de lavado en un matraz invertido, luego, lentamente, girar la botella en posición vertical y la oscilación del matraz para que la solución de lavado se mueve sobre el las células. Si esto no se hace con cuidado las células podrían detatch y pocos se quedarán después de los tres pasos de lavado. El lavado se repitió dos veces más, a continuación, 6 mL de los medios de comunicación se añaden al matraz y se incuba a 37 ° C durante 2 horas, luego fue trasladado a una incubadora de 28 ° C.
- Transfección éxito de pIRES2-EGFP construye se puede confirmar 1 a 3 días después de la transfección utilizando un microscopio de epifluorescencia. Las células que presentan fluorescencia verde cuando se expone a la luz UV son positivamente transfectadas y debe expresar el canal de iones y proteínas heterólogas eGFP.
3. Revestimiento de las células transfectadas HEK293T en la preparación de registro electrofisiológico
nt "> Los distintos canales de iones de expresarse con diferentes eficiencias en la membrana celular de las células HEK, y como tal, el resto de este protocolo requiere una optimización para maximizar la expresión de los canales de superficie que permite el éxito de registro electrofisiológico. Expresión heteróloga de canales iónicos en las células HEK, especialmente de los de animales no mamíferos fuentes, puede presentar algunos problemas, incluyendo (1) las proteínas de gran tamaño que requiere largos periodos de traducción y localización en la membrana plasmática (2) la ausencia o diferencias de plegado y la orientación motivos de la proteína del canal necesario en un mamífero línea celular (3) diferencias en las frecuencias de uso de codones de especie a especie. Todos estos factores combinados pueden resultar en un requisito para los tiempos de incubación largo a 28 ° C, lo que garantiza la expresión de proteínas eficaz y localización superficie sin la división celular (lo que diluiría a cabo el ADNc heterólogo y proteínas). Desafortunadamente, la incubación durante períodos prolongados a 28 ° C conduce al desapego y estabilidad de la membrana celular mala toma de registro electrofisiológico difícil. Decidimos modificar las estrategias convencionales de la transfección (revisado en Thomas y Smart 2005) con el fin de minimizar la incubación a 28 ° C antes de la grabación y para maximizar la expresión de la superficie. Nuestro método requiere que las células se transfectaron, se incuba durante un periodo de 3-7 días a 28 ° C, entonces las células se separan por tripsinización y replated en cubreobjetos y se incubaron a 37 º C, que restabilizes membranas y permite una unión fuerte de las células en cubreobjetos. Las células son capaces de ser registrados de inmediato, o pueden ser incubados por períodos adicionales de tiempo a 28 ° C. Se encuentra el replating de las células en cubreobjetos en esta etapa posterior en nuestro método es absolutamente esencial para la producción de cubreobjetos con un gran número de canales que expresan, separar las células adjunto.Se presentan dos estrategias alternativas, que preferimos utilizar los canales de iones y los complejos de los canales iónicos que no contienen grandes dominios extracelulares que pueden ser vulnerables a la digestión de la tripsina (por ejemplo, CAV3 voltaje canales de calcio, Senatore y Spafford 2010), y un que utilizamos para los canales iónicos que contienen grandes dominios extracelulares (por ejemplo, tipo L-voltaje canales de calcio y sus subunidades accesorias;. Senatore, et al 2010).
- Las células se incubaron a 28 ° C durante 2-6 días para evitar la división celular y para permitir la acumulación de la proteína traducida. Este tiempo de incubación debe ser determinada empíricamente para cada uno de los canales iónicos, ya que la expresión de la superficie depende de factores intrínsecos que determinan la forma de ARNm de los canales naciente y secuencias de polipéptidos interactuar con la maquinaria de traducción y de la vía secretora, respectivamente.
- Antes de placas, cubreobjetos circular de vidrio (Círculos No. 1 - 0,13 a 0,17 mm de espesor; Tamaño: 12 mm, Fisher Scientific Canadá, Ottawa, Ontario) están recubiertos con poli-L-lisina (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Los medios de comunicación se retira por aspiración de las células transfectadas, y 1 ml de 37 ° C tripsina solución (Sigma) es micropipetted a un matraz invertido (parte de células hacia arriba). El frasco se invierte suavemente a la posición vertical para permitir que la tripsina de atropellar a las células, y el matraz se vuelve a invertir y la tripsina retirados por aspiración. 250 l de tripsina caliente se añade directamente sobre las células y el frasco se incuba a 37 ° C durante 3-5 minutos hasta que el detatch células.
- Mientras tanto, el poli-L-lisina cubreobjetos se colocan en placas de cultivo de 6 mm (3.8 por plato) y 5 ml de medio de cultivo caliente se añade a cada plato.
- Las células con tripsina se resuspenden con 4 ml de medio de cultivo caliente pipeteando arriba y abajo ~ 6 veces, luego de 250 500μL de células resuspendidas se micropipetted en las placas de cultivo que contienen cubreobjetos. Antes de la adición de las células, la punta de la micropipeta se utiliza para empujar hacia abajo en los cubreobjetos para asegurarse de que están en el fondo del plato.
- Las células se incubaron a 37 º C durante 3 horas para que puedan cumplir con los cubreobjetos, y luego se transfieren a 28 ° C. En este punto, las células están listas para registro electrofisiológico, que está muy bien hecho con distintos conectados a las células (Fig. 3 ilustra las células transfectadas antes y después de la siembra en cubreobjetos). Dejando a las células durante mucho tiempo a 37 ° C se traducirá en la división celular.
- Preparación de las células que expresan canales / complejos de canal con grandes dominios extracelulares se lleva a cabo en la misma forma como se indicó anteriormente, con la excepción de que los cubreobjetos se incubaron a 28 ° C por un período adicional 2-4 días antes de registro electrofisiológico se lleva a cabo. Esto permite una re-acumulación de canales / canal complexes en la membrana celular después de la tripsina.
4. Registro electrofisiológico de los canales de recombinantes en células HEK-293T
Varios recursos integrales disponibles que describen los conceptos generales subyacentes de registro electrofisiológico (por ejemplo, Ogden y Stanfield, 1987; Molleman 2003).
4.1 Electrofisiología equipo
Un típico equipo de electrofisiología (Figura 4) incluye un amplificador (por ejemplo, Axopatch 200B o 700B MultiClamp amplificador, Axon Instruments, Union City, CA), un ordenador PC equipado con una interfaz Digidata 1440A convertidor de analógico a digital en conjunto con pClamp10.1 software (Molecular Devices, Sunnyvale, California), motorizados, manipuladores pipeta doble (MPC-385-2, la compañía de Sutter Instrument), un microscopio de epifluorescencia (Axiovert 40 CFL, Zeiss Canadá, Toronto, Ontario) y sistemas de perfusión (Figuras 4 y 5 ). Las vibraciones están limitadas por el montaje del equipo sobre una mesa de TMC 63-500 serie de aislamiento de vibración (Técnico Manufacturing Corporation, Peabody. MA). Ruido eléctrico callejero se limita el uso de 40 "de altura de tipo II jaula de Faraday (TMC) que rodea el equipo eléctrico montado en la tabla de aislamiento de vibraciones. Los sistemas electrónicos de control (como la computadora y el monitor, amplificador, convertidor analógico-digital, manipulador motorizado y perfusión ValveLink sistema de control) están montados fuera de la jaula de Faraday a una rejilla de metal independiente eléctrica (Hammond Manufacturing, Guelph en Ontario). Todo el equipo eléctrico esté conectado a un distribuidor de cobre y conectado a un transformador de aislamiento de grado médico (1800W, Tripp Lite UL60601-1) que proporciona aislamiento de la línea, un campo de constante y de supresión de sobretensiones.
Parche 4.2 pipetas
Tubos capilares de vidrio de borosilicato con filamento (OD de 1,5 mm, diámetro externo 0.86mm, 15 cm de longitud; BF150-86-15, la compañía de Sutter Instrument) se redujo a la mitad y se inserta en un Flaming / Brown Micropipeta Extractor modelo P-97 (Empresa Sutter Instrument) . Un programa de pipeta-tirador está optimizado para generar constantemente pipetas con las resistencias de entre 2 y 5MΩ desde el electrodo a tierra (después del pulido fuego, Fig. 6) Pipetas individualmente pulidas al fuego para suavizar las superficies de punta de la pipeta que permite un sellado hermético frente a las membranas celulares ( Micro Forge MF-830; Narishige, Japón, la Figura 6). Micropipetas están montados en el headstage con un soporte especializado (1-HL-U, Molecular Devices, Sunnyvale California).
4.3 electrodos de tierra
Los tubos de vidrio borosilicato utilizado para hacer pipetas parche también se utilizan para hacer los electrodos de referencia. Los tubos de 15 cm de largo se cortan en tres piezas. Con dos pinzas de punta fina, los tubos se mantienen en una llama de un mechero Bunsen hasta que el vidrio se vuelve maleable y el tubo se puede doblar a una "L" o "palo de hockey" forma con un ángulo de 90 grados. Mientras que los tubos de vidrio todavía están calientes, uno de los extremos es inmediatamente inmersos en un caliente CsCl 3M y el 1,5% de solución de agarosa que se introduce en el tubo por capilaridad. Una vez que un electrodo de referencia está completamente lleno de solución, se coloca en un vaso de agua fría. Después de todos los electrodos de referencia están llenas, son individualmente limpiar con Kimwipes para eliminar agarosa adicional desde el exterior y se sumergen en una solución de 3M CsCl. De registro electrofisiológico, los electrodos de referencia se llevan a cabo en un soporte de microelectrodos Half-Cells (titular de la 90 F de pellets de 1,5 mm; # MEH3RF15, World Precision Instruments Inc., Sarasota, Florida) lleno de solución de CsCl 3M. (Ver Figura 7 para la ilustración de un electrodo de tierra en la solución del baño)
4.4 Electrofisiología soluciones de grabación
Los diferentes tipos de canales iónicos dependientes de voltaje requieren soluciones diferentes en función de grabación de la permeabilidad de iones / selectividad. Para los canales de calcio dependientes de voltaje, las células suelen ser bañados en soluciones externas que contienen bario o de calcio en diferentes concentraciones. Por ejemplo, registro electrofisiológico de los invertebrados CAV3 los canales de calcio voltaje-dependientes (LCav3) se puede realizar utilizando una solución externa que contiene 5 mM CaCl 2, 166mm tetraetilamonio (TEA-Cl), HEPES 10 mM con un pH ajustado a 7,4 con TEA-OH. Pipetas de parches se llena con una solución interna de 125 CsCl, EGTA 10 mM, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, MgATP 4 mm, 0,3 mm Tris-GTP, y HEPES 10 mM con un pH de 7.2 (Senatore y Spafford, 2010). Los invertebrados de tipo L voltaje del canal de calcio (LCav1) se puede grabar utilizando una solución externa que contiene bario como el portador de la carga (15mm BaCl2, 1mM MgCl2, 10 mM HEPES, 40 mm de TEA-Cl, 72.5mM CsCl, glucosa 10 mM, con se ajusta el pH a 7,2 con TEA-OH) y una solución interna que contiene 108 mm C-metanosulfonato, 4 mm de MgCl 2, 9 mm EGTA, HEPES 9 mm, pH ajustado a 7,2 con CsOH (Senatore et al., 2010).
4.5 Grabación de células enteras
- Un cubreobjetos que contienen las células transfectadas (que expresan canales de iones heteróloga o complejos de canales de iones) se transfiere a un plástico de 35 mm placa de Petri que contiene 3 ml de solución de grabación ~ externo. El volumen de la solución de grabación debe ser medida con precisión cuando se realizan experimentos con drogas en cantidades conocidas de la droga se van a añadir a la cazuela con una micropipeta. Registros electrofisiológicos se realiza normalmente a temperatura ambiente, aunque el investigador puede desear cambiar la temperatura en función de la experiencia.
- Las células se visualizan a través de un microscopio de epifluorescencia y un hecho aislado, positivamente transfectadas, las células adherentes verde se centra en el medio del campo de visión.
- El parche pipeta se introduce en la solución del baño con un micromanipulador, que completa el circuito entre el electrodo en la pipeta de parches y el electrodo de referencia. En el modo de baño, el software hace que el amplificador pClamp10.1 para generar pequeñas repitiendo los pasos de tensión entre la pipeta y el electrodo de referencia, y muestra la corriente resultante como un rastro de onda cuadrada (Figura 8A). Esta traza de onda cuadrada debe poner a cero el uso de la pipeta de desplazamiento en el amplificador antes de parchear una célula. La resistencia a la pipeta se mide por el software pClamp10.1, y debe estar dentro de 2 5MΩ.
- En el modo de baño, la pipeta se pone en las proximidades de la célula, que se puede visualizar como las rápidas fluctuaciones en la traza de la onda cuadrada, a continuación, una pequeña cantidad de succión se aplica a la pipeta parche para formar un sello gigaohm entre la pipeta y la membrana (causa una completa línea plana de la traza de onda cuadrada, la figura 8B).
- El programa se cambia entonces a modo de parche, y la capacitancia pipeta (visibles como pequeños repuntes de la corriente en los bordes de ataque y salida de la traza actual de plano, la figura 8B) se compensa con la compensación de capacitancia pipeta en el amplificador.
- Una cantidad pequeña pero fuerte de la succión se aplica a la ruptura de la membrana en el parche y permitir el acceso del electrodo en el interior de la célula. El éxito de la rotura de membranas se indica por la aparición de grandes transitorios capacitivos en el borde de ataque y salida de la traza actual ola (Figura 8C). Una vez que romper se ha logrado, el programa está en modo de celular y la compensación de células enteras se ajusta la capacidad del amplificador para eliminar los transitorios capacitivos. Hay un retraso de unos pocos minutos para permitir el equilibrio de la solución de registro intracelular en la célula antes de la grabación.
- Comandos de tensión se generan y los datos se realiza a través de un ordenador equipado con una interfaz Digidata 1440A convertidor analógico a digital en conjunto con pClamp10.1 software. Únicos protocolos de fijación de voltaje se han escrito para cada experimento, y se utilizan para registrar las corrientes de los canales iónicos de las células transfectadas. La figura 9 ilustra las corrientes de calcio registrado partir de una célula HEK-293T expresando el invertebrado LCav3 voltaje del canal de calcio. La célula se llevó a cabo a una tensión de-110mV, y despolarizaciones incremental entre-70mV y 20 mV fueron tomadas para obtener corrientes de entrada de calcio.
- Corrientes registradas se filtran a 10 kHz con un paso bajo del filtro de Bessel y digitalizada a una frecuencia de muestreo de 2 kHz. Las grabaciones sólo con fuga mínima (<10%) se utilizan para el análisis, y en línea sustracción de fugas se lleva a cabo utilizando el software Clampfit 10,1.
4.6 Los estudios de medicamentos de células registradas
Los medicamentos pueden ser directamente pipeta en el plato que se está grabando. Concentración de las drogas se puede calcular si el volumen de drogas añadido y el volumen de solución del baño son conocidos. Cantidades caro o limitado de medicamentos también pueden ser añadidos por microperfusión de un colector multi-cañón poliimida lápiz de perfusión con una punta de 250 micras extraíble, ya sea utilizando un Smartsquirt ocho canales de presión del sistema de micro perfusión (AutoMate científico) o el sistema de flujo por gravedad operado a través de las válvulas de teflón Valvelink8 y controladores de válvulas (AutoMate Científico, ver Figura 5 para las configuraciones de sistema de perfusión). Caudales de los sistemas de microperfusión se han fijado en 0,1 ml por minuto en una corriente que sale del lápiz de perfusión de 400 micras de la célula registrado. La distancia de la punta de un lápiz de perfusión de la punta del electrodo de registro deberán ser uniformes de parche a parche, figura 10 ilustra una distancia sugerida visible en el aumento de 40x. Las tasas de flujo adecuado proporcionar la perfusión de saturación de la célula registrado. Antes de que un experimento de drogas se realiza utilizando microperfusión, las células se equilibró con el microperfusión de solución de control de baño en un flujo continuo. La mínima interrupción de la corriente se evita durante el experimento por un cambio rápido del baño de control, las drogas o la solución de lavado. Aspiración montado en el borde de la placa de registro se pueden utilizar to eliminar desbordamiento de las soluciones, por medio de succión manual con una jeringa o mediante un dispositivo impulsado por la bomba peristáltica (por ejemplo, MINISTAR miniatura DC bomba peristáltica, Instrumentos del Mundo de precisión). Se debe tener cuidado ya que la perfusión extremadamente rápido induce fuerzas de cizallamiento que pueden alterar la corriente de calcio (Peng et al. 2005), puede lavar la celda que se está grabando, y agota el depósito de medicamento demasiado rápido.
Pipeta directamente en el plato frente a los sistemas de perfusión
| Pipeteo directo | Sistema de perfusión micro | Flujo por gravedad sistema de perfusión | |
| Drogas volumen necesario | Moderado | Bajo | Alto |
| Habilidad técnica | Bajo | Medio | Medio |
| Costo del equipo | Bajo | Significativo | Significativo |
| El tiempo diario para la instalación y la limpieza | Ninguno | 20 + minutos | 20 + minutos |
| La contaminación del equipo | Ninguno | Sí | Sí |
| Solución de problemas | Fácil | Complejo | Complejo |
| Drogas garantizado en el plato | Sí | No | No |
| Perder celda con adicción a las drogas | Sí | Sí | Sí |
| Reducir en gran medida concentrado de drogas. por lavado | Difícil | Sencillo | Sencillo |
| Facilidad de hacer una curva dosis-respuesta múltiple | Inferior al óptimo | Sencillo | Sencillo |
| Reproducibilidad de los resultados | OK - depende de la ubicación de pipeteo | Bueno | Bueno |
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Discussion
Ser capaz de grabar de células enteras corrientes utilizando los protocolos descritos y las soluciones indica que la transfección se ha realizado correctamente y que la tensión deseada canales iónicos o complejos de los canales iónicos están presentes con importantes cantidades en la membrana celular. En caso de que las células transfectadas de manera positiva (es decir, verde fluorescente), pero no tienen corrientes de grabación, el tiempo adicional a los 28 ° C puede ser necesaria para permitir la proteína del canal de embalar de manera adecuada y se inserta en la membrana celular. Tenga en cuenta que la incubación prolongada a 28 ° C hace que las células se desprenden de los cubreobjetos, y las membranas desestabilizar y los desechos se acumulan las células muertas, lo que hace la grabación de patch clamp más difícil. Todos los tiempos sugeridos en este protocolo se han optimizado para nuestros canales en particular. Otros canales y sus subunidades pueden requerir más o menos los tiempos de incubación, y el protocolo puede ajustarse aún más, según sea necesario. Para algunos canales eficiencia de transfección pobres (es decir, menos células fluorescentes y baja intensidad de la fluorescencia por célula) produce mejores resultados que de manera eficiente transfectadas, las células altamente fluorescente. En caso de que las células fluorescentes, pero no tienen corrientes de grabación, los puntos de solución de problemas a tener en cuenta son: la falta de proteína accesoria (s), mezcla incorrecta de reactivos de transfección, sub-óptimas soluciones de grabación, y la mutación / recombinación de canal o canal subunidad construcciones de ADNc producir mal doblada o no expresar los canales.
Figura 1: riñón embrionario humano células 293T (HEK-293T) se cultivan en monocapa adherida a 37 º C en incubadoras de CO2 (CO2 5%) en frascos ventilados 25cm2 al 90% de confluencia y dividir a las 1:12, 01:08 y 01:04 diluciones. Las células suelen dividir dos veces por semana, a partir de una confluencia de ~ 90%. Para asegurar una similar a 90% de confluencia en la división, las células se dividen en una dilución 1:08 los lunes, y 01:12 los jueves. Antes de la transfección, un frasco totalmente confluente es división de 1:4 en un nuevo frasco, y las células que se pueden conectar a 37 º C en un incubador de CO2 durante 3-4 horas.
Figura 2: Estrategia para la expresión heteróloga de canales iónicos en células HEK-293T (izquierda) ADNc de canales de iones se clonó en el sitio de clonación múltiple del plásmido pIRES2-EGFP.. (Derecha) La transfección de estas construcciones en las células HEK resultados en la producción de moléculas de ARNm que contiene la secuencia de codificación de canal iónico (roja) justo aguas arriba de un sitio interno de entrada de ribosomas (IRES, el azul) y la secuencia de codificación eGFP (verde). Los canales iónicos son traducidos y transportados a la membrana celular a través de la sala de emergencia y sistema de endomembranas, mientras que eGFP se traduce y se mantiene en el citoplasma.
Figura 3:. Transfección y expresión heteróloga de ADNc de canales de iones en las células HEK-293T, y el revestimiento de las células en cubreobjetos de registro electrofisiológico (A) (paneles superiores) HEK-293T células se incubaron a 28 C, cuatro días después de la transfección con el LCav3 los canales de calcio albergado en el pIRES2-EGFP vector de expresión de mamíferos CMV. (Paneles inferiores), las células por encima de trypsinized y chapada en cubreobjetos de vidrio, aislado de registro electrofisiológico. La interferencia diferencial microscopía de contraste (DIC).
Figura 4:. Una típica configuración electrofisiológicos equipo de registro electrofisiológico componentes de equipo de grabación incluyen un amplificador (A), una computadora personal (PC), Digidata 1440A analógico-digital convertidor de interfaz (C), motorizados, manipuladores de doble pipeta (PM), un microscopio de epifluorescencia (M), sistemas de perfusión (P), TMC 63-500 vibración serie tabla de aislamiento (VT), 40 de altura Tipo II jaula de Faraday (FC), y un metal independiente, 19 de bastidor eléctrica (R).
Figura 5: Los sistemas de perfusión (A) Un sistema de flujo por gravedad operados con válvulas de teflón y controladores Valvelink8.. (B) Ocho Smartsquirt canal de sistema de presión de perfusión micro. Multi-Barril Consejo del colector de uno u otro sistema de perfusión se monta en un manipulador motorizado.
Figura 6:. Pipetas de pulido, el parche se muestra a 10x (izquierda) y 40x (derecha) ampliación Parche pipetas fueron generados a partir de tubos de vidrio borosilicato capilar con filamento y pulidas al fuego para suavizar las superficies de punta de la pipeta. Un programa de pipeta-tirador se ha optimizado para generar pipetas que le dio una lectura de 2-5MΩ electrofisiología en nuestro set-up.
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. Figura 7: electrodo de tierra y pipetas de patch en el plato de grabación parche pipeta (derecha) y la toma de tierra (a la izquierda, flecha blanca) en la solución de grabación.
Figura 8:. PClamp10.1 capturas de pantalla que ilustra los pasos de crear un parche (A) traza de onda cuadrada observa en el modo de baño. (B) Un sello Gigaohm en el modo de parche lleva a un aplanamiento de la traza de onda cuadrada con capacidad pipeta visible como blips pequeña de la corriente en los bordes de ataque y salida de la traza actual de plano. (C) Después de avance y en el modo de células grandes transitorios capacitivos se ven.
Figura 9:. Resultados de electrofisiología (izquierda) hacia el interior grabables voltaje las corrientes de calcio indica transfección éxito y la expresión heteróloga de canales iónicos (por ejemplo, LCav3). (Derecha) las células no transfectadas no tienen corrientes de grabación. Las células fueron sometidas a un protocolo IV, que especifica que el software mantienen a la célula en-110mV y luego paso a 70mV para 250msec luego de vuelta a 110mV con un potencial. Cada vez que el paso se incrementa en 10 mV para que los pasos son a-70mV, etc,-60mV hasta el último paso es 20 mV. Los resultados son de un invertebrado de tipo T (CAV3) voltaje homólogo del canal de calcio de L. stagnalis denomina LCav3.
Figura 10: Disposición de los electrodos y un lápiz microperfusión en solución de grabación (A) pipetas parche elaborado a partir de vidrio de borosilicato (derecha) y poliamida multi-cañón punta del colector de la perfusión del fármaco (izquierda).. Electrodo de tierra (de nuevo) de vidrio de borosilicato lleno de 3M CsCl y el 1,5% solución de agarosa se inclinó como palo de hockey celebrado en soporte de microelectrodos Half-Cells. (B) vista 40 veces a través de un microscopio de la punta del lápiz y la perfusión de microelectrodos de registro.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención de funcionamiento Discovery para JDS de la de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación (NSERC) de Canadá, una NSERC Alexander Graham Bell Canada Becas de Posgrado (doctorado) (A. Senatore) y la Fundación Heart and Stroke, Grant -En-Aid NA # 6284.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech Laboratories | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 - 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Micr–lectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments, Inc. | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige International | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).
- Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
