Summary
Zuverlässige Methode für hocheffiziente
Abstract
Die in vitro-Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinanten Spannungs-gesteuerte Ionenkanäle in kultivierten menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK-293T) ist eine weit verbreitete Forschungsstrategie. HEK-293T-Zellen müssen auf Deckgläschen bei niedrig genug Dichte ausplattiert werden, so dass sie nicht in Kontakt miteinander sind, um für die elektrophysiologische Ableitung ohne verwirrende Effekte durch mit benachbarten Zellen wenden können. Transfizierte Kanäle müssen auch mit hoher Effizienz zum Ausdruck an der Plasmamembran für whole-cell Patch-Clamp-Aufzeichnung von nachweisbaren Ströme über Geräuschpegel. Heterologe Ionenkanäle benötigen oft lange Inkubationszeiten bei 28 ° C nach der Transfektion, um eine ausreichende Membran-Expression zu erreichen, aber es gibt immer mehr Verluste von Zell-Adhäsions-und Deckglas Membranstabilität bei dieser Temperatur. Um dieses Problem zu umgehen, entwickelten wir eine optimierte Strategie zur Transfektion und Platte HEK-293T-Zellen. Diese Methode erfordert, dass die Zellen auf einem relativ hohen Konfluenz transfiziert werden, und bei 28 ° C für unterschiedliche Inkubationszeiten nach der Transfektion für eine angemessene Ionenkanal-Protein-Expression zu ermöglichen. Die transfizierten Zellen werden dann auf Deckgläschen ausplattiert und bei 37 ° C für mehrere Stunden, die für starre Bindung an die Zelle Deckgläser und Membran Restabilisierung ermöglicht. Die Zellen können kurz nach der Beschichtung erfasst werden, oder kann bis 28 ° C für weitere Inkubation übertragen werden. Wir finden, dass die anfängliche Inkubation bei 28 ° C, nach der Transfektion, aber vor dem Ausplattieren Schlüssel für die effiziente Expression heterologer Ionenkanäle, die normalerweise nicht exprimieren auch an der Plasmamembran ist. Positiv transfiziert werden kultivierten Zellen durch Co-Ausdruck eGFP oder eGFP identifiziert ausgedrückt aus einer bicistronischen Vektor (zB pIRES2-EGFP) mit dem rekombinanten Ionenkanal cDNA kurz vor einer internen Ribosomeneintrittsstelle und eine eGFP kodierende Sequenz. Whole-cell Patch-Clamp-Aufzeichnung erfordert spezialisierte Einrichtungen, sowie die Crafting aus poliertem Aufnahme Elektroden und L-förmigen Masseelektroden aus Borosilikatglas. Drug-Delivery zur Pharmakologie von Ionenkanälen Studie kann direkt Mikropipettierung Drogen in die Aufnahme Gericht oder durch Verwendung Mikroperfusion oder Abflussrohre Systeme, die ununterbrochene Ströme von Drogen-Lösung produzieren über aufgezeichneten Zellen erreicht werden.
Protocol
1. Cell Culture
- Mit 6 mL Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM, Sigma Aldrich) Humane embryonale Nierenzellen 293T-Zellen (HEK-293T, Invitrogen) sind in adhärente Monolayer in entlüftet 25cm 2 Flaschen (; CELLSTAR Greiner Bio-One Zellkultur behandelt) gewachsen, das mit 10 % v / v fötales Rinderserum (FBS; Sigma Aldrich), 1% Natriumpyruvat und 250 ug / ml Penicillin / Streptomycin bei 37 ° C mit 5% CO 2).
Die Zellen werden in CO 2-Inkubatoren inkubiert (5% CO 2) gesetzt, um entweder 37 ° C oder 28 ° C. Alle Arbeiten mit Zellen in einer Sterilbank durchgeführt. - Die Zellen sind in der Regel zweimal wöchentlich, von ~ 90% Konfluenz aufgeteilt, in ein 1:8-Verdünnung montags, donnerstags und 1:12 auf. (Siehe Abbildung 1 für Bilder von HEK-293T-Zellen ausplattiert auf unterschiedliche Dichten)
- Für die Spaltung, die Medien aus den Flaschen von Zellen abgesaugt und die Zellen werden durch die Anwendung 1ml von Trypsin (Sigma Aldrich) Lösung erhitzt auf 37 ° C an den invertierten Kolben gelöst. Der Kolben wird anschließend invertiert und sanft gewiegt von der Hand, so dass die Trypsin-Lösung über die anhaftenden Zellen mehrfach bewegt. Das Trypsin wird dann schnell durch Absaugen und 250 ul Trypsin ist in den Kolben, die wieder einmal erschüttert ist, die Trypsin-Lösung in den Zellen bewegen micropipetted entfernt.
- Flaschen werden dann in einem CO 2-Inkubator inkubiert eingestellt auf 37 ° C für 3-5 Minuten und einer Pipette wird verwendet, um die Zellen in 4 ml warmes ergänzt DMEM auszusetzen. Unvollständige Trypsinierung und Fahrwerk führt zu Klumpen von Zellen und könnte dazu führen, Zellen nach oben und nicht wachsen in den vorgesehenen Monoschicht. Over-Trypsinierung kann zur Beschädigung der Zellen.
- Für ein 1:8-Split, fügen Sie 500μL der suspendierten Zellen werden in eine neue Flasche mit 5.5mL DMEM hinzugefügt; für 1:12 aufgeteilt (siehe Abbildung 1), 333μL von Zellen, um eine neue Flasche mit 5.7mL DMEM hinzugefügt . Flaschen werden sanft gemischt und dann zu einem 37 ° C Inkubator überführt. Während der 3-4h Inkubation bei 37 ° C nach der Trennung werden die Zellen sedimentieren und sich an den Kolben. Die Zellen zunächst umsehen aber flach und Erweiterungen (Pseudopodien) mit fester Bindung (Abbildung 1).
Die Zellen sollten in einem Anhänger Monoschicht in einer vorhersagbaren Weise zu wachsen. Sollte das Zellwachstum und das Erscheinungsbild atypisch sein oder inkonsistent, schlechte Technik oder Verunreinigungen (Bakterien / Mykoplasmen) erwogen werden. Der Schlüssel zum erfolgreichen Gewebekultur ist die Konsistenz.
2. Transfektion von HEK-293T mit rekombinantem Ionenkanal cDNAs
- Hier werden cDNAs aus verschiedenen Ionenkanäle in der geklonten pIRES2-EGFP-Plasmid (BD Biosciences Clontech), die für die Identifizierung der positiv transfizierten Zellen über Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) Fluoreszenz erlaubt. Die eGFP ist in transfizierten Zellen aus dem gleichen Protokoll wie das klonierte Insert cDNA, durch die Übersetzung in eine interne Ribosomeneintrittsstelle initiiert kurz hinter dem Einsatz cDNA und vor dem eGFP kodierende Sequenz (Abbildung 2) produziert. Siehe Abbildung 3 für Bilder von fluoreszierenden HEK-293T, positiv mit Calcium-Kanal-Untereinheiten in pIRES2-EGFP-Konstrukten transfiziert.
- Vor der Transfektion ist eine vollständig konfluenten Flasche 1.04 in eine neue Flasche aufgeteilt, und die Zellen werden bei 37 ° C legen in einer CO 2-Inkubator für 3-4 Stunden (siehe Abbildung 1).
- Nachdem die Zellen gebunden sind, ist ein Standard-Calciumphosphat-Transfektion Strategie (Cold Spring Harbor-Protokolle) verwendet werden, um Konstrukte, die Ionenkanal-und Accessoire-Untereinheit cDNAs in den HEK-Zellen einzuführen. In der Regel insgesamt 12μg DNA in 600 ul der Transfektion Lösung ise pro Flasche / Transfektion verwendet.
- Nach der Transfektion Lösung über den Zellen tropfenweise pipettiert wird, wird der Kolben in ein 37 ° C Inkubator über Nacht gelegt.
- Nach der Transfektion werden die Zellen vorsichtig dreimal mit warmen Medien-oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen (4-5 mL) durch Pipettieren der Waschlösung in einem umgekehrten Kolben, dann langsames Drehen der Flasche aufrecht und rocken die Flasche, so dass die Waschlösung bewegt sich über die Zellen. Wenn dies nicht der Fall sorgfältig die Zellen konnten ablösen und nur wenige werden nach den drei Waschschritte gelassen werden. Die Wäsche noch zwei weitere Male wiederholt wird, dann 6 ml Medien sind in den Kolben gegeben und es ist bei 37 ° C für 2 Stunden, dann zu einem 28 übertragen ° C inkubiert.
- Erfolgreiche Transfektion von pIRES2-EGFP-Konstrukte können 1 bis 3 Tage nach der Transfektion mit dem Epifluoreszenzmikroskop bestätigt werden. Zellen, die grün fluoreszieren unter UV-Licht ausgesetzt sind, positiv-transfizierten und sollte die heterologe Ionenkanäle und eGFP exprimieren.
3. Plating transfizierten HEK293T Zellen in Vorbereitung für die elektrophysiologische Ableitung
nt "> Verschiedene Ionenkanäle exprimieren, mit unterschiedlichen Wirkungsgraden an der Zellmembran von HEK-Zellen, und als solche erfordert den Rest dieses Protokoll einige Optimierungen an Kanaloberfläche Ausdruck erlaubt für eine erfolgreiche elektrophysiologische Ableitung zu maximieren. Expression von heterologen Ionenkanäle in HEK-Zellen, insbesondere bei solchen aus Nicht-Säuger-Quellen, können derzeit einige Herausforderungen, einschließlich (1) großes Protein Größen, die eine lange Zeit zu übersetzen und lokalisieren, um die Plasmamembran (2) Fehlen oder Unterschiede von Falt-und Targeting-Motive auf dem Kanal Protein, das in einem Säugetier- Zelllinie (3) Unterschiede in der Kodonverwendung Frequenzen von Spezies zu Spezies. Alle diese Faktoren zusammen können in einer Forderung nach langen Inkubationszeiten bei 28 ° C ergeben, die effektive Protein-Expression und Lokalisation Oberfläche gewährleistet, ohne die Zellteilung (die Verdünnung aus der heterologen cDNAs und Proteinen). Leider Inkubation über längere Zeiträume bei 28 ° C führt zu Zellablösung und schlechte Membranstabilität machen elektrophysiologische Ableitung schwierig. Wir haben uns entschieden zu herkömmlichen Transfektion Strategien ändern (reviewed in Thomas und Smart 2005), um Inkubation minimieren bei 28 ° C vor der Aufzeichnung und die Oberfläche Ausdruck zu maximieren. Unsere Methode erfordert, dass Zellen transfiziert, inkubiert werden für einen Zeitraum von 3-7 Tagen bei 28 ° C, dann Zellen durch Trypsinierung abgelöst und replattiert auf Deckgläsern und bei 37 ° C, die Membranen restabilizes und ermöglicht starke Bindung von Zellen auf Deckgläsern. Die Zellen werden dann in der Lage, sofort aufgenommen werden, oder können für zusätzliche Zeiträume bei 28 ° C bebrütet Wir finden die Wiederbelegung von Zellen auf Deckgläser zu diesem späteren Zeitpunkt in unserer Methode für unbedingt notwendig für die Herstellung von Deckgläsern mit einer hohen Zahl von Kanal-exprimierenden, separate anhaftenden Zellen.Wir stellen zwei alternative Strategien, eine, die wir lieber für Ionenkanäle und Ionenkanal-Komplexe, die keine großen extrazellulären Domänen, die anfällig für Trypsinverdauung (zB CAV3 spannungsabhängigen Calcium-Kanäle; Senatore und Spafford 2010) kann zu verwenden, und eine dass wir für die Ionenkanäle, die große extrazellulären Domänen enthalten (zB L-Typ spannungsabhängigen Calcium-Kanäle und deren Zubehör-Untereinheiten;. Senatore, et al 2010).
- Die Zellen werden bei 28 ° C für 2-6 Tage, um die Zellteilung zu verhindern und für die Akkumulation von translatierten Proteins ermöglichen inkubiert. Diese Inkubationszeit muss empirisch für jede Ionenkanal bestimmt werden, da Oberflächenexpression ist abhängig von intrinsischen Faktoren, wie die Kanäle 'im Entstehen begriffenen mRNA-und Polypeptidsequenzen mit der translationalen Maschinen und den sekretorischen Weg zu interagieren, bzw. zu diktieren.
- Vor Beschichtung, runde Deckgläser (Circles Nr. 1 bis 0,13 bis 0,17 mm dick; Größe: 12 mm, Fisher Scientific Canada, Ottawa, Ontario) sind mit Poly-L-Lysin (Sigma) gemäß den Anweisungen des Herstellers beschichtet.
- Media ist durch Aspiration aus transfizierten Zellen entfernt und 1 mL 37 ° C Trypsin-Lösung (Sigma) in einem umgekehrten Kolben (Zelle nach oben) micropipetted. Der Kolben wird dann vorsichtig in die aufrechte Position gedreht, um damit die Trypsin über die Zellen laufen, und der Kolben wird dann wieder umgedreht und das Trypsin durch Absaugen entfernt. 250 ul warmen Trypsin wird dann direkt über den Zellen gegeben und der Kolben wird bei 37 ° C für 3-5 Minuten, bis die Zellen ablösen.
- Inzwischen sind Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläser in 6mm Kulturschalen platziert (3-8 pro Schale) und 5 ml warmes Kulturmedien ist zu jedem Gericht aufgenommen.
- Trypsiniert Zellen mit 4 ml warmes Kulturmedien werden durch Auf-und Abpipettieren ~ 6 mal resuspendiert, dann 250-500μL der resuspendierten Zellen werden in die Kulturschalen mit Deckgläsern micropipetted. Vor der Zugabe von Zellen, ist die Spitze der Mikropipette verwendet werden, um nach unten drücken, auf den Deckgläschen, um sicherzustellen, dass sie an der Unterseite der Schale sind.
- Die Zellen werden dann bei 37 ° C für 3 Stunden, damit sie die Deckgläser halten, und dann sind sie auf 28 ° C übertragen An dieser Stelle werden die Zellen bereit für die elektrophysiologische Ableitung, die im Idealfall mit separatem-attached-Zellen (Abb. 3 verdeutlicht transfizierten Zellen vor und nach der Beschichtung auf Deckgläsern) durchgeführt wird. Verlassen der Zellen zu lange bei 37 ° C wird bei der Zellteilung führen.
- Vorbereitung der Zellen, die Kanäle / Kanal-Komplexe mit großen extrazellulären Domänen erfolgt in der gleichen Weise wie oben angegeben, mit der Ausnahme, dass Deckgläschen bei 28 ° C für eine zusätzliche 2-4 Tage vor elektrophysiologische Ableitung erfolgt sind, inkubiert. Dies ermöglicht eine erneute Anhäufung von Kanälen / Kanal complexes an der Zellmembran nach Trypsinierung.
4. Elektrophysiologische Erfassung von rekombinanten Kanäle in HEK-293T-Zellen
Mehrere umfassende Ressourcen zur Verfügung stehen, die beschreiben, die allgemeinen Konzepte zugrunde liegenden elektrophysiologischen Aufnahmen (zB Ogden und Stanfield 1987; Molleman 2003).
4,1 Elektrophysiologie rig
Ein typisches Elektrophysiologie rig (Abbildung 4) enthält einen Verstärker (zB Axopatch 200B oder 700B Multiclamp Verstärker; Axon Instruments, Union City, CA), einem PC mit einem Digidata 1440A Analog-Digital-Wandler-Schnittstelle in Verbindung mit pClamp10.1 ausgestattet Software (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornien), motorisiert, dual Pipette Manipulatoren (MPC-385-2, Sutter Instrument Company), einem Epifluoreszenzmikroskop (Axiovert 40 CFL, Zeiss Canada, Toronto, Ontario) und Perfusion Systemen (Abbildungen 4 und 5 ). Vibrationen werden durch die Montage des Gerätes auf einem TMC 63-500 Serie Schwingungsisolierung Tabelle (Technical Manufacturing Corporation, Peabody. MA) begrenzt. Streunende elektrisches Rauschen beschränkt ist mit einem 40 "tall Type II Faraday Cage (TMC) rund um die elektrische Ausrüstung von der Schwingungsisolierung Tisch montiert. Elektronische Steuerungen (z. B. Computer und Monitor, Verstärker, Analog-Digital-Wandler, motorisierte Manipulator und ValveLink Perfusion Steuerung) befinden sich außerhalb des Faradayschen Käfigs, um eine freistehende Metall Elektro-Rack (Hammond Manufacturing, Guelph Ontario) montiert. Alle elektrischen Geräte, um eine Kupfer-Verteiler geerdet ist und an eine Medical Grade Isolation Transformator (1800W, Tripp Lite UL60601-1), die Linie Isolation, eine einheitliche Grund-und Überspannungsschutz bietet.
4,2 Patch-Pipetten
Borosilikatglas Kapillaren mit Filament (OD 1,5 mm, OD 0.86mm, 15cm Länge; BF150-86 bis 15; Sutter Instrument Company) sind in zwei Hälften geschnitten und in eine Flaming / Brown Micropipette Puller Modell P-97 (Sutter Instrument Company) . Eine Pipette-Abzieher-Programm wurde optimiert, um konsequent zu generieren Pipetten mit Widerständen zwischen 2 bis 5MΩ von der Elektrode auf Masse (nach Feuerpolitur; Abb.6) Pipetten einzeln Feuer poliert, um die Pipettenspitze Flächen, die für Abdichtungen gegen Zellmembranen ermöglicht glatt ( Micro Forge MF-830; Narishige, Japan; Abbildung 6). Mikropipetten sind auf der headstage mit einem spezialisierten Halter (; Molecular Devices, Sunnyvale Kalifornien 1-HL-U) montiert.
4,3 Masse-Elektroden
Das Borosilikatglas Rohre verwendet werden, um Patch-Pipetten machen werden auch zur Referenz-Elektroden machen. Die 15cm langen Röhren sind in 3 Stücke schneiden. Mit 2 spitzen Pinzette werden die Rohre in einer Bunsenbrennerflamme gehalten, bis das Glas formbar und der Schlauch kann zu einem "L" oder "hockey stick"-Form mit einem Winkel von 90o Winkel gebogen werden. Während die Glasröhren noch heiß sind, ist ein Ende sofort in einen heißen 3M CsCl und 1,5% igen Lösung, die in das Rohr durch Kapillarwirkung gezogen eingetaucht. Sobald eine Referenz-Elektrode ist vollständig mit Lösung gefüllt ist, wird es in einen Becher kaltes Wasser gelegt. Nach all der Referenzelektroden gefüllt sind, werden sie einzeln mit Kimwipes abgewischt, um zusätzliche Agarose von außen zu entfernen und in einer 3M CsCl-Lösung getaucht. Mit 3M CsCl-Lösung gefüllt für die elektrophysiologische Ableitung sind die Referenz-Elektroden in einer Mikroelektrode Halter Half-Cells (; # MEH3RF15 World Precision Instruments Inc., Sarasota Florida Halter 90 F Pellet 1,5 mm) gehalten. (Siehe Abbildung 7 zur Veranschaulichung einer Masseelektrode in Badlösung)
4,4 Elektrophysiologie Recording-Lösungen
Verschiedene Arten von spannungsabhängigen Ionenkanälen erfordern unterschiedliche Recording-Lösungen je nach Ionenpermeabilität / Selektivität. Für Spannung Kalziumkanäle, werden die Zellen üblicherweise in externen Lösungen, die entweder Barium oder Kalzium in unterschiedlichen Konzentrationen getaucht. Zum Beispiel kann elektrophysiologische Ableitung der wirbellosen CAV3 spannungsabhängigen Calcium-Kanal (LCav3) erfolgt über eine externe Lösung mit 5 mM CaCl 2, 166mm Tetraethylammonium (TEA-Cl), 10mm HEPES mit einem pH-Wert auf 7,4 mit TEA-OH werden. Patch-Pipetten sind mit einer internen Lösung von 125mm CsCl, 10 mM EGTA, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 4mm MgATP, 0,3 mm Tris-GTP und 10 mM HEPES mit einem pH-Wert von 7,2 (Senatore und Spafford, 2010) gefüllt. Die wirbellosen L-Typ spannungsabhängigen Calcium-Kanal (LCav1) können mittels einer externen Lösung mit Barium als Ladungsträger (15mm BaCl2, 1 mM MgCl 2, 10mM HEPES, 40 mM TEA-Cl, 72.5mm CsCl, 10 mM Glucose, mit sein der pH-Wert auf 7,2 mit TEA-OH) und eine interne Lösung mit 108mm Cs-Methansulfonat, 4mm MgCl 2, 9mm EGTA, 9mm HEPES, pH-Wert auf 7,2 mit CsOH (Senatore et al., 2010).
4,5 Whole Cell Recording
- Ein Deckglas mit transfizierten Zellen (Expression heterologer Ionenkanäle oder Ionenkanal-Komplexe) ist ein 35-mm-Petrischale aus Kunststoff mit ~ 3 ml externe Recording-Lösung übertragen. Das Volumen der Recording-Lösung muss genau gemessen werden bei der Durchführung von Drogen-Experimenten, bei denen bekannte Mengen von Drogen sind auf die Schale mit einer Mikropipette zugegeben werden. Elektrophysiologischen Ableitungen werden in der Regel bei Raumtemperatur durchgeführt, obwohl die Forscher darf diese Temperatur je nach Experiment zu verändern.
- Die Zellen werden visualisiert durch eine Epifluoreszenzmikroskop und eine isolierte, positiv-transfizierten, Anhänger grüne Zelle ist in der Mitte der Mitte des Sichtfeldes.
- Die Patch-Pipette in die Badlösung mit einem Mikromanipulator, der den Stromkreis schließt zwischen der Elektrode in der Patch-Pipette und der Referenzelektrode gesenkt. Während in Bad Modus bewirkt, dass die pClamp10.1 Software Verstärker für kleine sich wiederholende Spannung Schritte zwischen der Pipette und der Referenzelektrode zu generieren, und zeigt der resultierende Strom als ein Rechtecksignal trace (Abbildung 8A). Dieses Rechteck Spur muss auf Null mit der Pipette auf den Verstärker vor dem Patchen einer Zelle verrechnet werden. Die Pipette Widerstand wird durch die pClamp10.1 Software gemessen und sollte innerhalb von 2-5MΩ werden.
- Während in Bad-Modus, der Pipette in der Nähe der Zelle, die man sich als schnelle Schwankungen in der Rechteckspannung Spur gebracht wird, dann eine kleine Menge von Saug-auf die Patch-Pipette angewendet, um eine Gigaohm Abdichtung zwischen Pipette und Form der Membran (bewirkt eine vollständige Flachbild-line des Rechtecksignals Spur; Abbildung 8B).
- Das Programm wird dann auf Patch-Modus geschaltet und Pipette Kapazität (als winzige Lichtpunkte der Strom auf der Vorder-und Hinterkante der Wohnung aktuellen Spur, 8B) wird mit der Pipette Kapazität Entschädigung auf den Verstärker kompensiert.
- Eine kleine, aber scharfe Höhe von Saug wird angewandt, um Bruch der Membran in der Patch-und erlauben den Zugriff der Elektrode an der Innenseite der Zelle. Erfolgreiche Blasensprung ist durch das Auftreten von großen kapazitiven Transienten ebenfalls auf der Vorder-und Hinterkante der derzeitigen Welle trace (Abbildung 8C) angegeben. Einmal durch das Erreichte zu brechen, das Programm zu Zelle Modus und ganze Kapazität der Zelle Kompensation eingeschaltet ist am Verstärker angepasst werden, um den kapazitiven Transienten zu entfernen. Es gibt eine Verzögerung von wenigen Minuten bis zur Äquilibrierung der intrazellulären Recording-Lösung in die Zelle vor der Aufnahme zu ermöglichen.
- Spannung Befehle generiert und Daten erfasst mithilfe eines Computers mit einem Digidata 1440A Analog-Digital-Wandler-Schnittstelle in Verbindung mit pClamp10.1 Software ausgestattet. Einzigartige Voltage-Clamp-Protokolle sind für jedes Experiment geschrieben, und diese werden verwendet, um Ionenkanal Ströme von transfizierten Zellen aufnehmen. Abbildung 9 zeigt Kalzium Ströme aus einer HEK-293T-Zelle, die den wirbellosen LCav3 spannungsabhängigen Calcium-Kanal aufgezeichnet. Die Zelle wurde bei einer Spannung von-110mV gehalten, und inkrementelle depolarisations zwischen-70mV und +20 mV wurden ergriffen, um nach innen Calcium Ströme hervorrufen.
- Aufgenommen Ströme bei 10 kHz mit einem Low-Pass-Bessel-Filter gefiltert und digitalisiert mit einer Sampling-Frequenz von 2 kHz. Nur Aufnahmen mit minimaler Leckage (<10%) sind für die Analyse verwendet und offline Leck Subtraktion erfolgt über die Clampfit 10,1-Software durchgeführt.
4,6 Drug Studien aufgenommenen Zellen
Medikamente können direkt in die Schüssel aufgezeichnet pipettiert werden. Die Konzentration der Medikamente kann berechnet werden, wenn das Volumen der Droge zugegeben und das Volumen der Badlösung bekannt sind. Teure oder begrenzte Mengen von Drogen kann auch durch Mikroperfusion aus einer Multi-Barrel vielfältig hinzugefügt werden Polyimid Perfusion Stift mit 250 micron abnehmbare Spitze, entweder mit einem Acht-Kanal-Smartsquirt Druck micro Perfusion System (AutoMate Scientific) oder Schwerkraft-System durch Teflon-Ventile betrieben und Valvelink8 Ventilsteuerungen (AutoMate Scientific, siehe Abbildung 5 für die Perfusion System-Setups). Fördermengen von Mikroperfusion Systeme sind bei 0,1 ml pro Minute in einem Strom Verlassen der Perfusion Bleistift 400 Mikrometer aus der aufgenommenen Zelle gesetzt. Der Abstand der Perfusion Bleistiftspitze von der Aufnahme Elektrodenspitze sollte im Einklang von Patch zu Patch; Abbildung 10 zeigt einen empfohlenen Abstand sichtbar bei 40x Vergrößerung. Angemessene Flussraten bieten Sättigung Perfusion der aufgenommenen Zelle. Bevor ein Medikament Experiment wird mit Mikroperfusion werden Zellen äquilibriert mit dem Mikroperfusion Kontrolle Badlösung in einen kontinuierlichen Strom. Minimaler Unterbrechung des Stroms während des Experiments durch schnelles Umschalten von der Steuerung Bad, Drogen-oder Waschlösung vermieden. Absaugung an den Rand der Aufnahme Schüssel montiert t verwendet werdeno entfernen Überlauf von Lösungen, durch manuelle Absaugung mit einer Spritze oder mit einer peristaltischen Pumpe angetrieben Gerät (zB MINISTAR Miniatur DC Schlauchpumpen, World Precision Instruments). Es muss darauf geachtet, da eine extrem schnelle Perfusion induziert Scherkräfte, dass das Kalzium aktuelle verändern kann (Peng et al. 2005), kann wegspülen die Zelle aufgenommen wird, und erschöpft das Medikament Reservoir zu schnell.
Direkt Pipettieren in Schale vs Perfusionssysteme
| Direkte Pipettieren | Micro Perfusion System | Gravity flow Perfusion System | |
| Volume Medikament benötigt | Mäßig | Niedrig | Hoch |
| Technische Fähigkeiten | Niedrig | Medium | Medium |
| Ausrüstung Kosten | Niedrig | Signifikant | Signifikant |
| Täglich Time to Vorbereitung und Aufräumen | Keiner | 20 + Minuten | 20 + Minuten |
| Die Kontamination von Ausrüstung | Keiner | Ja | Ja |
| Fehlerbehebung | Leicht | Komplex | Komplex |
| Garantierte Medikament in Schale | Ja | Nicht | Nicht |
| Lose Zelle mit Drogenabhängigkeit | Ja | Ja | Ja |
| Stark Reduzierung des Drogenkonsums konz. durch Waschen | Schwierig | Unkompliziert | Unkompliziert |
| Ease of Doing ein Vielfaches Dosis-Wirkungs-Kurve | Weniger als optimal | Unkompliziert | Unkompliziert |
| Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse | OK - abhängig vom Standort des pippeting | Gut | Gut |
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Discussion
Die Möglichkeit, whole-cell Ströme unter Verwendung der beschriebenen Protokolle und Lösungen Datensatz zeigt, dass die Transfektion erfolgreich war und dass die gewünschte Spannung Ionenkanälen oder Ionenkanal-Komplexe vorhanden sind, mit erheblichen Mengen an der Zellmembran. Sollten die Zellen positiv transfiziert werden (dh grün fluoreszierend), aber nicht beschreibbare Strömungen, zusätzliche Zeit bei 28 ° C erforderlich, um für die Kanal-Protein richtig verpackt werden und in die Zellmembran ermöglichen kann. Beachten Sie, dass eine längere Inkubation bei 28 ° C regt die Zellen aus dem Deckgläschen zu lösen, und Membranen zu destabilisieren und reichern sich Trümmer von toten Zellen, so dass Patch-Clamp-Aufnahme eine größere Herausforderung. Alle Uhrzeiten in diesem Protokoll vorgeschlagen haben für unsere besondere Kanäle optimiert. Andere Kanäle und ihre Untereinheiten kann verlangen, länger oder kürzer Inkubationszeiten und unsere Protokoll kann weiter angepasst werden, wie gebraucht. Für bestimmte Kanäle schlechte Transfektionseffizienz (dh weniger fluoreszierende Zellen und niedrigere Fluoreszenzintensität pro Zelle) bessere Ergebnisse als effizient transfiziert, stark fluoreszierende Zellen. Sollte Zellen fluoreszierende aber nicht beschreibbare Ströme, Fehlersuche Punkte zu berücksichtigen: ein Mangel an akzessorischen Proteins (s); unsachgemäße Vermischung von Transfektionsreagenzien; sub-optimal-Recording-Lösungen, und Mutation / Rekombination von Kanal oder Kanal-Untereinheit cDNA-Konstrukte Herstellung unsachgemäß gefaltet oder nicht-exprimierende Kanäle.
Abbildung 1: Humane embryonale Nierenzellen 293T-Zellen (HEK-293T) sind in adhärente Monolayer bei 37 ° C in CO2-Inkubatoren (5% CO2) in entlüftet 25cm2 Flaschen zu 90% Konfluenz gezüchtet und Split am 01.12, 1:8 und 1:4 Verdünnungen. Die Zellen sind in der Regel alle zwei Wochen, von einem ~ 90% Konfluenz aufgeteilt. Um eine ähnliche ~ 90% Konfluenz zu spalten, werden die Zellen in ein 1:8-Verdünnung am Montag gespalten, und 1:12 am Donnerstag. Vor der Transfektion ist eine vollständig konfluenten Flasche 1.04 in eine neue Flasche aufgeteilt, und die Zellen dürfen bei 37 ° C in einem CO2-Inkubator legen für 3-4 Stunden.
Abbildung 2: Strategie für die heterologe Expression von Ionenkanälen in HEK-293T (links) Ionenkanal-cDNAs in die multiple Klonierungsstelle des pIRES2-EGFP kloniert.. (Rechts) Transfektion dieser Konstrukte in HEK-Zellen führt zur Produktion von mRNA-Molekülen, die die Ionenkanal-codierende Sequenz (rot) kurz vor einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES; blau) und die eGFP kodierende Sequenz (grün). Ionenkanäle sind übersetzt und pendelte an der Zellmembran über das ER und Endomembransystem, während eGFP übersetzt und behielt in das Zytoplasma.
Abbildung 3:. Transfektion und Expression heterologer Ionenkanal cDNAs in HEK-293T-Zellen und Plattieren von Zellen auf Deckgläser für die elektrophysiologische Ableitung (A) (Top-Panels) HEK-293T-Zellen bei 28 inkubiert C, 4 Tage nach der Transfektion mit dem LCav3 Kalziumkanäle in der pIRES2-EGFP Säugetieren CMV-Expressionsvektor beherbergt. (Bottom-Panels) Die vorstehenden Zellen mit Trypsin behandelt und vernickelt auf Deckgläser, isoliert für die elektrophysiologische Ableitung. Differential Interference Contrast-Mikroskopie (DIC).
Abbildung 4:. Eine typische elektrophysiologische Ableitung rig Setup Elektrophysiologische Aufzeichnung rig Komponenten gehören ein Verstärker (A), einem Personal Computer (PC), Digidata 1440A Analog-Digital-Wandler-Schnittstelle (C), motorisiert, dual Pipette Manipulatoren (PM), einem Epifluoreszenzmikroskop (M), Perfusion Systeme (P), TMC 63-500 Serie Schwingungsisolierung Tabelle (VT), 40 große Type II Faraday Cage (FC) und einer freistehenden 19 Metall-, Elektro-Rack (R).
Abbildung 5: Perfusion Systeme (A) A Schwerkraft betrieben mit Teflon-Ventile und Steuerungen Valvelink8.. (B) Acht-Kanal Smartsquirt Druck micro Perfusion System. Multi-Barrel Manifold Tipp entweder Perfusion System basiert auf einer motorischen montiert.
Abbildung 6:. Poliert, Patch-Pipetten mit 10x (links) und 40x (rechts) Vergrößerung gezeigt Patch-Pipetten wurden aus Borosilikatglas Kapillarrohre mit Faden und Feuer poliert, um die Pipettenspitze glatte Oberflächen erzeugt werden. Eine Pipette-Abzieher-Programm wurde optimiert, um Pipetten, eine Lesung von 2-5MΩ in unserer Elektrophysiologie Set-up gab zu generieren.
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. Abbildung 7: Ground-Elektrode und Patch-Pipetten in die Aufnahme Gericht Patch-Pipette (rechts) und Masseelektrode (links; weißer Pfeil) in Recording-Lösung.
Abbildung 8:. PClamp10.1 Screenshots, welches die Schritte der Herstellung eines Patches (A) Rechtecksignal Spur beobachtet werden, wenn in Bad-Modus. (B) A Gigaohm Dichtung in Patch-Modus führt zu einer Abflachung des Rechtecksignals Spur mit Pipette Kapazität als winzige Lichtpunkte der Strom auf der Vorder-und Hinterkante der Wohnung aktuellen Spur. (C) Nach dem Durchbruch und gleichzeitig in der Zelle Modus werden große kapazitive Transienten gesehen.
Abbildung 9:. Elektrophysiologie Ergebnisse (links) Recordable innen spannungsabhängige Calciumkanäle Ströme zeigt die erfolgreiche Transfektion und Expression von heterologen Ionenkanäle (zB LCav3). (Rechts) transfizierte Zellen haben keine beschreibbare Ströme. Die Zellen wurden auf eine IV-Protokoll, dass die Software die Zelle an-110mV halten und dann Schritt-70mV für 250ms dann wieder auf-110mV Haltepotential gibt unterzogen. Jedes Mal, wenn der Schritt erhöht sich um 10 mV, so dass die Schritte, um-70mV,-60mV usw. bis zum letzten Schritt wird bis +20 mV. Die Ergebnisse werden für eine wirbellosen T-Typ (CAV3) spannungsabhängigen Calcium-Kanal-Homolog von L. stagnalis bezeichnet LCav3.
Abbildung 10: Anordnung der Elektroden und Mikroperfusion Bleistift in Recording-Lösung (A) Patch-Pipetten aus Borosilikatglas (rechts) gefertigt und Polyimid Multi-Barrel vielfältig Tipp für Drogen-Perfusion (links).. Masseelektrode (hinten) aus Borosilikatglas mit 3M CsCl und 1,5% Agarose-Lösung gefüllt gebogen als Hockeyschläger in Microelectrode Halter Half-Cells statt. (B) 40x Blick durch ein Mikroskop der Perfusion Bleistiftspitze und Aufzeichnung Mikroelektroden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Discovery Betriebskostenzuschuss zur JDS aus den Naturwissenschaften und unterstützten Engineering Research Council (NSERC) of Canada, ein NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate-Stipendien (Promotion) (zu A. Senatore) und die Heart and Stroke Foundation, Grant -In-Aid NA # 6284.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech Laboratories | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 - 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Micr–lectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments, Inc. | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige International | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).
- Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
