Summary
고효율을위한 신뢰할 수있는 방법
Abstract
체외의 표현과 교양 인간의 배아 신장 세포에 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 electrophysiological 기록에 (HEK - 293T) 유비 쿼터스 연구 전략이다. 그들은 인접 세포와 접촉으로 인한 혼란함을 주죠 효과없이 electrophysiological 레코딩을위한 수 있도록 서로 접촉되지 않도록 HEK - 293T 세포가 낮은만큼 밀도에 유리 coverslips에 도금해야합니다. Transfected 채널은 또한 소음 수준 이상의 감지 전류를 전체 세포 패치 클램프 레코딩을위한 플라즈마 막 높은 효율로 표현합니다. Heterologous 이온 채널은 종종 ° C transfection 후 적절한 막 표현을 달성하기 위해 28에서 긴 배양 기간을 필요로하지만,이 온도에서 셀 coverslip 부착 및 막 안정성의 손실을가 증가하고 있습니다. 이 문제를 회피하기 위해, 우리는 transfect 및 플레이트 HEK - 293T 세포에 최적화된 전략을 개발했습니다. 이 방법은 세포가 28에서 비교적 높은 confluency에서 transfected하고, incubated 있어야 ° 적절한 이온 채널 단백질 표현을 할 수 있도록 배양 기간 후 transfection 변화를위한 C. Transfected 세포는 다음 유리 coverslips에 도금 및 37 ° C coverslips 및 멤브레인 restabilization에 엄격한 세포 부착을 허용 몇 시간에 대한 incubated 수 있습니다. 전지는 곧 도금 후 녹음하거나 ° C 더 배양을 위해 28 전송할 수 있습니다. 우리는 28의 초기 부화 ° C, transfection 후 있지만 도금하기 전에는 일반적으로 플라즈마 막에서 잘 표현하지 heterologous 이온 채널의 효율적인 표현을위한 열쇠입니다 것을 발견했습니다. 긍정적으로 transfected, 교양 세포는 단지 상류 내부 ribosome 항목 사이트 및 eGFP 코딩 시퀀스의 cDNA 재조합 이온 채널을 포함하는 bicistronic 벡터 (예 : pIRES2 - EGFP)에서 표현 공동 표현 eGFP 또는 eGFP에 의해 식별됩니다. 전체 세포 패치 클램프 녹음 전문 장비를 필요 플러스 borosilicate 유리 광택 기록 전극과 L 자형 접지 전극의 crafting. 이온 채널의 약리학 연구를 마약 배달 직접 녹음 요리로 마약을 micropipetting에 의해, 또는 microperfusion 또는 기록된 세포 이상 약물 솔루션의 중단 흐름을 생산 비중 흐름 시스템을 사용하여 얻을 수 있습니다.
Protocol
1. 세포 배양
- 10과 보충, Dulbecco의 수정 이글스 중간 (시그마 알드리치 DMEM)의 6mL를 포함하는 인간 배아 신장 293T 세포 (HEK - 293T, Invitrogen) 통풍 25cm 2 flasks (그라 이너 바이오 - 하나,, Cellstar 처리 조직 문화)에 자기편 monolayers에서 재배 % V / V 태아 소 혈청 (FBS; 시그마 알드리치), 1 %의 나트륨 pyruvate, 37 250 μg / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 ° C와 5 % CO 2).
세포 중 37 ° C 또는 28 ° C. 설정 (5 % CO 2) CO 2 incubators에 incubated 아르 세포와 함께 모든 작업은 층류 후드에서 수행됩니다. - 세포는 일반적으로 월요일에서 1시 8분 희석에서 ~ 90 % confluency에서 격주 분할하고, 목요일 1시 12분 있습니다. (다른 밀도에 HEK - 293T 세포 도금의 이미지를 그림 1 참조)
- 분할의 경우, 미디어는 열망에 의해 세포의 flasks에서 제거하고, 세포 ° C 거꾸로 술병에 37 가열 트립신 (시그마 알드리치) 솔루션의 1mL을 적용하여 떨어뜨려졌다. 플라스크는 손으로 후 거꾸로하고 부드럽게 누볐어되는 트립신 용액을 여러 번 첨부된 세포를 통해 이러한 움직임. 트립신은 다음 신속하게 열망 250 트립신의 μL 다시 한번 세포를 통해 트립신 용액을 이동 누볐어있는 술병에 micropipetted 의해 제거됩니다.
- Flasks은 다음 CO 2 배양기에서 incubated하는 것은 ° C 3~5분에 대해 37로 설정하고, 피펫은 따뜻한 보충 DMEM의 4mL의 세포를 중단하는 데 사용됩니다. 불완전한 trypsinization과 정지는 세포의 대단히 짧은 시간의 원인이되며 세포가 의도 monolayer에 이상이 아닌 성장을 일으킬 수 있습니다. 이상 - trypsinization는 세포가 손상될 수 있습니다.
- 1시 8분 분할 경우, 정지 세포의 500μL DMEM의 5.5mL를 포함하는 새로운 플라스크에 추가를 추가, 1시 12분 분할을 위해 (그림 1 참조), 세포의 333μL은 DMEM의 5.7mL를 포함하는 새로운 플라스크에 추가됩니다 . Flasks는 부드럽게 후 37 ° C 배양기로 전송 혼합됩니다. 37 3 - 4h 인큐베이션 기간 동안 ° C 분리 후 세포 침전물되며, 술병을 준수. 세포는 처음 내내 보이지만 평평하고 firmer 첨부 파일 (그림 1)과 확장 (pseudopodia)을해야합니다.
세포는 예측 가능한 방식으로 자기편 monolayer 성장한다. 세포 성장 및 외관은 비정형 또는 일관성, 가난한 기술 또는 오염 (세균 / mycoplasma)로 간주되어야한다. 성공적인 조직 문화의 핵심은 일관성이다.
2. 재조합 이온 채널 cDNAs와 HEK - 293T의 Transfection
- 여기 다양한 이온 채널에서 cDNAs가로 복제하는 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 형광을 통해 적극적으로 transfected 세포의 식별을 허용하는, (BD Biosciences Clontech) pIRES2 - EGFP 플라스미드. eGFP 그냥 스트림 cDNA와 eGFP 코딩 순서 (그림 2)의 상류 삽입의 내부 ribosome 항목을 사이트에서 시작한 번역을 통해 cDNA 복제된 삽입과 같은 성적 증명서에서 transfected 세포에서 생산됩니다. 긍정적 pIRES2 - EGFP 구조에 칼슘 채널 subunits와 transfected HEK - 293T 형광등의 이미지에 대한 그림 3을 참조하십시오.
- 이전 transfection에 완벽하게 합류 플라스크는 새로운 플라스크에 1시 4분를 분리하고, 세포는 37 첨부할 수있게됩니다 ° C는 CO 2 배양기에서 3-4 시간을 위해 (그림 1 참조).
- 세포 부착 후, 표준 칼슘 인산염 transfection 전략 (콜드 스프링 하버 프로토콜)는 HEK 세포에 이온 채널 및 액세서리 subunit의 cDNAs를 포함하는 구성을 소개하는 데 사용됩니다. 일반적으로, transfection 솔루션 이세 600 μL의 DNA의 12μg의 총 술병 / transfection 당 사용됩니다.
- transfection 솔루션 세포 드롭 현명한 이상 pipetted되면 술병은 밤 동안 37 ° C 배양기에 배치됩니다.
- 다음 transfection은, 세포가 신중하게 따뜻한 미디어 또는 인산과 세 번 씻은하는 것은 술병을 거꾸로 플라스크에 씻어 솔루션을 pipetting 후 천천히 똑바로 술병을 돌려 락을하여 (4-5 ML) 호수 버퍼 있도록 통해 세척 솔루션은 이동 세포. 이것이 신중하지 않으면 세포가 detatch 수 있으며, 몇 가지는 세 단계 세척 후 남아있을 것입니다. 세척은 두 번 더 반복, 다음 미디어 6 ML은 술병에 추가하고 그것은 ° 다음 28 이전 2 시간에 대한 C, ° C 배양기 37 incubated입니다.
- pIRES2 - EGFP 구조의 성공적인 transfection은 1~3일 epifluorescence 현미경을 사용하여 transfection 후 확인하실 수 있습니다. 자외선에 노출되면 녹색 형광 세포 긍정적 - transfected하며 heterologous 이온 채널 및 eGFP의 단백질을 표현한다.
3. 도금은 electrophysiological 녹화 준비 HEK293T 전지를 transfected
NT "> 다른 이온 채널은 HEK 세포의 세포막에서 다른 효율성과 표현, 그리고 같은,이 프로토콜의 나머지 성공 electrophysiological 녹화 있도록 채널 표면 표현을 최대화하기 위해 몇 가지 최적화가 필요합니다. HEK 세포에 heterologous 이온 채널의 표현, 특히 비 포유류의 소스에서 이들의 (1) 긴 시간을 필요로하는 대형 단백질 크기 번역 및 플라즈마 막 (2) 부재 또는 포유 동물에 필요한 채널 단백질에 대한 주제를 접는 및 타겟팅 dissimilarities에 집중하는 등 일부 문제점을 소개합니다 세포주 (3) 종을 종 코돈 사용 빈도의 차이. 결합된 이러한 요소들은 모두 28 긴 배양 시간에 대한 요구가 발생할 수 있습니다 ° 세포 분열없이 효과적인 단백질 발현 및 표면 현지화을 보장 C (아웃 희석 것이 어떤 heterologous cDNAs 및 단백질). 불행히도 28에서 연장 기간 동안 부화 ° C는 세포 분리 및 electrophysiological 녹음이 어렵게 가난한 막 안정성로 연결됩니다. 우리는 부화를 최소화하기 위해 (토마스 및 스마트 2005 년 검토) 종래의 transfection 전략을 수정하기로 결정 28 ° C 이전에 녹음하고 표면 표현을 극대화할 수 있습니다. 우리의 방법은 세포가 28 3~7일 기간 동안 incubated, transfected 있어야 ° C 후, 세포가 trypsinization에 의해 분리하고 coverslips에 replated 37에서 incubated 아르 ° 세포막을 restabilizes하고 coverslips에 세포의 강한 부착을 허용 C는. 세포가 바로 녹음하실 수 있습니다, 또는 28 시간의 추가 기간 동안 incubated 수 있습니다 ° C. 우리는이 나중 단계에서 coverslips에 세포의 replating를 찾을 수 채널 표현의 높은 숫자, 별도의 첨부 전지 coverslips 생산을위한 절대적으로 필수적으로 우리의 방법 인치, 한, 두 가지 대안 전략, 우리는 트립신의 소화 (Senatore 및 스패 포드 2010 예 Cav3 전압 - 게이 티드 칼슘 채널)에 취약할 수 있습니다 대규모 세포외 도메인을 포함하지 않는 이온 채널과 이온 채널 단지에 사용하고자하는 것이 하나를 제시 우리는 (.; Senatore, 외 2,010 예 : L - 타입 전압 - 게이 티드 칼슘 채널 및 액세서리 subunits) 대형 세포 도메인을 포함하지 이온 채널에 사용.
- 전지는 28 ° C 세포 분열을 방지하고 번역 단백질의 축적 수 있도록 2-6일위한 incubated 수 있습니다. 표면 표현이 채널 '초기 mRNA와 polypeptide 시퀀스는 각각 translational 기계 및 분비 경로와 상호 작용하는 방법을 지시 본질적인 요인에 의존되기 때문에이 부화 시간은 각 이온 채널에 대해 경험적으로 결정되어야합니다.
- 이전 도금으로, 원형 유리 coverslips (동아리 번호 1-0.13 0.17mm 두께에, 크기 : 12mm, 피셔 사이 언티픽 캐나다, 오타와, 온타리오)는마다 제조 업체의 지침과 같은 폴리 - L - 라이신 (시그마)로 코팅하고 있습니다.
- 미디어 transfected 세포에서 흡인하여 제거하고, 37 일 ML은 ° C 트립신 용액 (시그마)는 거꾸로 플라스크 (최대 셀 사이드)에 micropipetted입니다. 플라스크는 부드럽게 트립신은 세포를 통해 실행할 수 있도록 수직 위치로 반전되고 술병 나서 다시 반전되고 트립신는 열망에 의해 삭제되었습니다. 따뜻한 트립신 250 μL 그 다음 세포를 통해 직접적으로 추가되고 술병은 37 incubated 수 있습니다 ° C 셀 detatch까지 3~5분하십시오.
- 한편, 폴리 - L - 라이신 - 코팅 coverslips는 6mm 문화 요리에 배치 (요리 당 3-8)와 따뜻한 문화 미디어의 5 ML 각 요리에 추가됩니다.
- Trypsinized 세포 및 아래로 pipetting ~ 6 번으로 따뜻한 문화 미디어의 4mL로 resuspended 있으며, 다음 resuspended 세포의 250 500μL는 coverslips를 포함하는 문화 요리에 micropipetted 있습니다. 세포의뿐만 아니라 이전에 micropipette의 끝들은 접시의 맨 아래에 있는지 확인하기 위해 coverslips에 내려와서하는 데 사용됩니다.
- 세포는 다음 3hrs에 대한 ° C 그들이 coverslips을 준수 수 있도록 37 incubated 있으며, 그리고 그들은 28 ° C.으로 전송됩니다 이 시점에서, 세포가 이상적으로 별도의 연결된 전지 (Fig.3은 coverslips에 도금 전후 transfected 세포를 보여줍니다)로 이루어집니다 electrophysiological 녹음을위한 준비가되어 있습니다. 37 너무 오래를위한 세포를두면 ° C는 세포 분열의 결과 것입니다.
- 대형 세포외 도메인과 채널 / 채널 단지 표현 세포의 준비는 coverslips가 ° electrophysiological 녹화하기 전에 추가 2~4일에 대한 C가 수행됩니다 28 incubated 것을 제외하고 위에 표시된만큼 동일한 방식으로 수행됩니다. 이것은 채널 / 채널 C의 다시 축적을 허용trypsinization 후 세포막에 omplexes.
4. HEK - 293T 세포에 재조합 채널의 Electrophysiological 기록
여러 종합 자원 electrophysiological 녹음을 (; Molleman 2,003 예 : 오그 던과 스탠 1987) 기본 일반적인 개념을 설명하는 것이 가능합니다.
4.1 전기 생리학 장비
, pClamp10.1와 함께 Digidata 1440A 아날로그 - 디지털 컨버터 인터페이스를 갖춘 PC 컴퓨터, 전형적인 전기 생리학 장비 (그림 4) 증폭기 (액슨 악기, 유니온 시티, CA 예 Axopatch 200B 또는 700B 앰프를 Multiclamp) 포함 소프트웨어 (분자 디바이스, 서니 베일, 캘리포니아), 전동, 듀얼 피펫 manipulators (MPC - 385-2, 서터 악기 회사), epifluorescence 현미경 (Axiovert 40 CFL, 자이스 혈구 캐나다, 토론토, 온타리오) 및 재관류 시스템 (그림 4 및 5 ). 진동은 TMC 63-500 시리즈 진동 절연 테이블 (기술 제조 회사, 피바디. MA)에 장비를 장착하여 제한됩니다. 스트레이 전기 노이즈가 진동 절연 테이블에 장착된 전기 설비를 둘러싼 40 "키 타입 II 패러데이 케이지 (TMC)를 사용하여 제한됩니다. 전자 제어 시스템 (예 : 컴퓨터 및 모니터, 증폭기, 아날로그 - 디지털 변환기, 전동 조작하는 사람과 같은 Valvelink 재관류 제어 시스템)은 무료 서 금속 전기 랙 (하몬드 제조, 겔프 온타리오)에 패러데이 케이지 밖으로 탑재하고 있습니다. 모든 전기 장비가 구리 유통을 금지하고 의료 학년 절연 Tranformer (1800W, 트립 라이트에 연결 라인 분리, 일관성있는 지상 및 서지 억제를 제공 UL60601 - 1).
4.2 패치 pipettes
필라멘트 (; BF150 - 86-15, OD 1.5mm, OD 0.86mm, 15cm 길이 서터 악기 회사)와 Borosilicate 유리 모세관 튜브는 반으로 자르고에 삽입하는 브라운 Micropipette 풀러 모델 / 플라밍 P - 97 (서터 악기 회사) . (Pipettes 개별적으로 세포 점막에 대한 꽉 물개 수있는 피펫 팁 표면을 부드럽게하기 위해 광택 화재되며 피펫 - 풀러 프로그램은 지속적으로 접지 전극에서 2 5MΩ (Fig.6 화재 연마 후) 사이에 resistances와 pipettes를 생성하기 위해 최적화되어 있습니다 마이크로 포지 MF - 830, Narishige, 일본, 그림 6). Micropipettes는 전문 홀더 (; 분자 디바이스, 캘리포니아 서니 베일 1 - HL - U)와 headstage에 탑재하고 있습니다.
4.3 그라운드 전극
패치 pipettes를 만들기 위해 사용되는 borosilicate 유리 튜브는 참조 전극을 만들기 위해 사용됩니다. 15cm 긴 튜브는 3 조각으로 절단됩니다. 유리가 가단되고 튜브가 "L"또는 90o 각도로 "하키 스틱"모양으로 구부러진 수있을 때까지이 미세하게 밀고 포셉로 튜브는 알콜 램프의 불꽃에서 개최됩니다. 유리 튜브는 여전히 매력적 있지만 한쪽은 즉시 뜨거운 3M CsCl과 모세관 현상에 의해 튜브에 그려진 1.5 % 아가로 오스 솔루션에 포장되어 있습니다. 참조 전극이 완전히 솔루션으로 가득되면, 그것은 차가운 물을 비커에 배치됩니다. 참조 전극 모두 채워진 후, 개별적으로 외부에서 추가 아가로 오스를 제거하는 Kimwipes로 닦아 있으며 3M CsCl 솔루션에 빠져들 수 있습니다. 3M CsCl 용액으로 가득 electrophysiological 녹음 들어, 참조 전극은 Microelectrode 홀더 하프 셀 (세계 정밀 계측기 주식 회사, 사라소타 플로리다,, # MEH3RF15 홀더 90 F 펠렛 1.5mm)에 개최됩니다. (욕조 솔루션의 접지 전극의 그림에 대한 그림 7 참조)
4.4 전기 생리학 녹화 솔루션
전압 - 게이 티드 이온 채널의 종류 이온 투과성 / 선택성에 따라 다양한 녹화 솔루션을 필요로합니다. 전압 - 문이 칼슘 채널에 대한 세포는 일반적으로 다양한 농도의 바륨이나 칼슘 중 하나를 포함하는 외부 솔루션에 목욕을하고 있습니다. 예를 들어, 무척추 동물 Cav3 전압 - 게이 티드 칼슘 채널 (LCav3)의 electrophysiological 녹음 차 OH와 7.4으로 조정 산도와 5mM CaCl 2, 166mM tetraethylammonium (차 - CL), 10mM HEPES를 포함하는 외부 솔루션을 사용하여 수행할 수 있습니다. 패치 pipettes은 125mM CsCl, 10mM EGTA, 2mM CaCl 2, 1mM MgCl 2, 4mm짜리 MgATP, 0.3mM 트리스 - GTP, 및 7.2 (Senatore와 스패 포드, 2010)의 산도와 10mM HEPES의 내부 솔루션으로 채워지게된다. 무척추 동물 L - 타입 전압 - 게이 티드 칼슘 채널 (LCav1)은 전하 캐리어 (15mM BaCl2, 1mM MgCl 2, 10mM의 HEPES, 40mM 차 - CL, 72.5mM CsCl, 10mM 포도당과 같은 바륨이 들어있는 외부 솔루션을 사용하여 기록할 수 차 오와 7.2 조정 산도) 및 108mM CS - methanesulfonate, 4mm짜리 MgCl 2, 9 미리 EGTA, 9 밀리의 HEPES, CsOH (Senatore 외와 7.2 산도 조정을 포함하는 내부 솔루션., 2010).
4.5 전체 휴대폰 녹음
- transfected 세포를 (heterologous 이온 채널이나 이온 채널 단지 표현)가 포함된 coverslip는 외부 녹음 솔루션의 ~ 3mL를 포함 35mm 플라스틱 페트리 접시로 전송됩니다. 약물의 알려진 금액 micropipette 함께 그릇에 추가로 아르 약물 실험을 수행할 때 녹화 솔루션의 볼륨이 정확하게 측정해야합니다. 연구자가 실험에 따라이 온도를 변경하실 수 있습니다 Electrophysiological 있지만 기록은 일반적으로 상온에서 할 수 있습니다.
- 세포는 epifluorescence 현미경을 통해 시각이며, 절연, 긍정적 - transfected, 자기편 녹색 세포는보기의 필드의 중앙에 중심이다.
- 패치 피펫은 패치 피펫의 전극과 기준 전극 사이의 회로를 완료 micromanipulator를 사용하여 목욕 솔루션으로 저하됩니다. 목욕 모드에있는 동안, pClamp10.1 소프트웨어는 피펫과 참조 전극 사이에 작은 전압을 반복 단계를 생성하기 위해 앰프의 원인, 그리고 광장 파도 추적 (그림 8A)로 결과 전류를 표시합니다. 이 사각형 웨이브 추적은 패치 휴대하기 전에 앰프에 오프셋 피펫을 사용하여 제로해야합니다. 피펫 저항은 pClamp10.1 소프트웨어 측정하고, 2 5MΩ 내에 있어야합니다.
- 목욕 모드에있는 동안, 피펫이 광장 파도 추적 급격한 변동으로 시각 수있는 세포의 가까이에 가지고있다, 그때 흡입의 작은 금액은 피펫 사이 gigaohm 도장을 형성하기 위해 패치 피펫에 적용됩니다 멤브레인 (사각형 파 추적의 전체 평면 라인을 원인, 그림 8B).
- 이 프로그램은 다음 패치 모드로 전환되며, 피펫의 용량은 (평면 현재 추적의 선도 및 후행 가장자리에 현재의 작은 blips으로 보이는, 그림 8B) 앰프에 피펫 커패시턴스 보상과 보상이다.
- 흡입의 작지만 날카로운 금액은 패치에 파열 멤브레인를 적용 세포의 내부에 전극의 액세스를 허용합니다. 성공 막 파열도 선도하고 현재의 파도 추적의 가장자리 (그림 8C)을 후행에 큰 용량성 과도의 모양으로 표시됩니다. 일단 달성되었습니다 통해 휴식, 프로그램이 셀 모드와 전체 세포 용량 보상으로 전환됩니다는 용량성 과도를 제거하는 앰프에 조정됩니다. 녹음하기 전에 세포에 세포 녹화 솔루션의 평균 수 있도록 몇 분 지연이있다.
- 전압 명령이 생성되고 데이터가 pClamp10.1 소프트웨어와 함께 Digidata 1440A 아날로그 - 디지털 컨버터 인터페이스를 갖춘 컴퓨터를 사용 취득합니다. 고유 전압 클램프 프로토콜은 각 실험 기록하고 있으며, 이러한 transfected 세포의 이온 채널 전류를 기록하는 데 사용됩니다. 그림 9는 무척추 동물 LCav3 전압 - 문이 칼슘 채널을 표현 HEK - 293T 세포에서 기록된 칼슘 전류를 보여줍니다. 세포는 - 110mV의 전압에서 개최되었고, 및 20 MV - 70mV 사이의 증분 depolarisations는 안으로 칼슘 전류를 이끌어내는으로 이송되었다.
- 기록된 전류는 낮은 패스 베셀 필터를 사용하여 10 kHz에서에서 필터와 2 kHz에서의 샘플링 주파수에 디지털됩니다. 최소한의 누출 (<10 %)에서만 레코딩은 분석에 사용하고 있으며, 오프라인 누출 뺄셈은 Clampfit 10.1 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다.
기록된 세포의 4.6 약물 연구
마약 직접 기록되는 그릇에 pipetted 수 있습니다. 약물의 볼륨을 추가하고 목욕 솔루션의 볼륨이 알려진 경우 약물의 농도가 계산됩니다. 약물의 값비싼 또는 한정된 수량도 테프론 밸브를 통해 운영 중 여덟 채널 Smartsquirt 압력 마이크로 관류 시스템 (자동화 과학) 또는 중력 흐름 시스템을 사용하여 250 미크론 이동식 팁과 재관류의 연필을 polyimide 멀티 배럴 매니폴드에서 microperfusion에 의해 추가될 수도 있습니다 그리고 Valvelink8 밸브 컨트롤러 (과학을 자동화, 재관류 시스템 설정에 대한 그림 5 참조). microperfusion 시스템의 유량은 재관류 연필 기록된 세포에서 400 미크론을 종료 스트림에서 분당 0.1mL로 설정되어 있습니다. 기록 전극 팁에서 재관류의 연필 팁의 거리는 패치에서 패치를 일관되어야, 그림 10는 40x 확대에 보이는 제안 거리를 보여줍니다. 적절한 흐름 속도가 기록된 세포의 포화의 세례를 제공합니다. 약물 실험이 microperfusion를 사용하여 실시하기 전에, 전지 지속적인 스트림에 컨트롤 목욕 솔루션의 microperfusion과 equilibrated 있습니다. 스트림의 최소한의 중단은 제어 목욕, 약물 또는 세척 솔루션의 신속한 전환하여 실험 도중 피해야합니다. 레코딩 접시의 가장자리에 탑재된 흡입은 T를 사용할 수 있습니다O는 주사기 또는 연동 펌프 구동 장치 (예 : MINISTAR 미니어처 DC 연동 펌프, 세계 정밀 계측기)를 이용한 수동 흡입에 의해, 솔루션의 오버플로를 제거합니다. 매우 빠른 재관류가 칼슘 전류를 변경할 수 있습니다 전단 세력 유도 후 치료를 받아야한다 (펭 외 있습니다. 2005), 기록되는 세포를 멀리 세척하고, 너무 빨리 약물 저수지 depletes 수 있습니다.
직접 요리 대 재관류 시스템에 pipeting
| 직접 pipetting | 마이크로 관류 시스템 | 중력 흐름 재관류 시스템 | |
| 볼륨 약물이 필요 | 보통 | 낮은 | 높은 |
| 기술 기술 | 낮은 | 중 | 중 |
| 장비 비용 | 낮은 | 상당한 | 상당한 |
| 설정 및 정리하기 위해 매일 시간 | 없음 | 20 + 분 | 20 + 분 |
| 장비의 오염 | 없음 | 예 | 예 |
| 문제 해결 | 쉽게 | 복잡한 | 복잡한 |
| 접시에 보장 약물 | 예 | 아니 | 아니 |
| 마약 추가로 세포를 잃고 | 예 | 예 | 예 |
| 약물 CONC을 대폭 줄일 수 있습니다. 세탁에 의해 | 어려운 | 똑바른 | 똑바른 |
| 여러 선량 반응 곡선을하고 용이 | 최적 미만 | 똑바른 | 똑바른 |
| 결과의 재현성 | OK - pippeting의 위치에 따라 좌우 | 좋은 | 좋은 |
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Discussion
설명 프로토콜 및 솔루션을 사용하여 전체 셀 전류를 기록할 수있다는 것은 transfection가 성공하고 원하는 전압 - 게이 티드 이온 채널이나 이온 채널 단지는 세포막에서 상당한 수량에 참석하는 것을 나타냅니다. 세포가 적극적으로 transfected (즉, 형광 녹색)하지만 기록 전류, 28에서 추가 시간 ° C가 제대로 포장하고 세포막에 삽입되는 채널 단백질을 허용해야 할 수 있습니다이 없습니다되어야합니다. 28에서 해당 장시간 배양 참고 ° 패치 클램프 녹음 더 도전하고, C는 세포가 coverslips에서 분리로 인해, 그리고 세포막은 죽은 세포의 잔해를 불안정하게하고 축적. 이 프로토콜의 제안 시대의 모든 우리의 특정 채널에 대한 최적화되었습니다. 다른 채널과 subunits가 길거나 짧은 배양 시간을 요구할 수 있으며 필요에 따라 우리의 프로토콜이 추가로 조정할 수 있습니다. 특정 채널에 대한 가난한 transfection 효율 (즉, 적은 형광 셀 및 셀 당 낮은 형광 강도) 효율적으로 transfected 높은 형광 세포보다 더 나은 결과를 생성합니다. 해야 세포가 형광 수 있지만 기록 전류 포함 고려해야 할 문제 해결 포인트가 없습니다 : 액세서리 단백질 (S)의 부족, transfection의 시약의 혼합 부적 절한, 하위 최적의 레코딩 솔루션, 그리고 돌연변이 / 채널 또는 채널의 재조합 부적절하게 생산 cDNA 구조를 subunit를 접힌 또는 이외의 채널을 표현.
그림 1 : 인간 배아 신장 293T 세포 (HEK - 293T) confluency 90 % 통풍 25cm2 flasks의 CO2 incubators에서 37oC (5 % CO2)에서 자기편 monolayers 재배 및 1시 12분, 1시 8분 및 1시 4분에 분할 아르 dilutions. 세포는 일반적으로 ~ 90 % confluency에서 격주 분할됩니다. 비슷한 ~ 90 % 분리에 confluency을 보장하기 위해, 전지 월요일 1시 8분 희석에 분할하고, 목요일 1시 12분 있습니다. 이전 transfection에 완벽하게 합류 플라스크는 새로운 플라스크에 1시 4분를 분리하고, 세포는 3-4 시간을위한 CO2 인큐베이터에서 37oC에서 첨부할 수 있습니다.
그림 2 : HEK - 293T의 이온 채널의 heterologous 표현 전략 (왼쪽) 이온 채널 cDNAs이 플라스미드 pIRES2 - EGFP의 여러 복제 사이트에 복제됩니다.. 그리고 eGFP 코딩 순서 (녹색), 순서를 코딩 이온 채널 (적색) 단 상류 내부 ribosome 항목 사이트 (파란색 IRES)를 포함하는 mRNA 분자의 생산에 HEK 세포 결과에 이러한 구성의 (오른쪽) Transfection. eGFP가 번역 및 세포질에 남아있는 동안 이온 채널은 번역과 ER 및 endomembrane 시스템을 통해 세포막에 shuttled 있습니다.
그림 3 :. Transfection 및 heterologous 이온 채널 HEK - 293T 세포에 cDNAs하고, electrophysiological 녹음 coverslips에 세포의 도금의 표현 (A) (상단 패널) HEK - 293T 세포는 28 incubated C, 함께 꼬박 4 일을 이후 transfection pIRES2 - EGFP 포유류의 CMV 표현 벡터에 숨겨 LCav3 칼슘 채널. (하단 패널) 상기 세포가 trypsinized 유리 coverslips에 도금, electrophysiological 녹음 격리. 차동 간섭 대비 현미경 (DIC).
그림 4 :. 전형적인 electrophysiological 녹화 장비 설치는 Electrophysiological 레코딩 장비 부품 증폭기 (A), 개인용 컴퓨터 (PC), Digidata 1440A 아날로그 - 디지털 컨버터 인터페이스 (C), 전동, 듀얼 피펫 manipulators (PM)를 포함 epifluorescence 현미경 (M), 재관류 시스템 (P), TMC 63-500 시리즈 진동 절연 테이블 (VT), 40 키 타입 II 패러데이 케이지 (FC) 및 무료 서 19 금속, 전기 랙 (R).
그림 5 : 재관류 시스템 (A) 중력 흐름 시스템은 테플론 밸브 및 Valvelink8 컨트롤러를 사용하는 조작.. (B) 에이트 채널 Smartsquirt 압력 마이크로 관류 시스템. 중 재관류 시스템의 멀티 바렐 매니폴드 팁는 전동 조작하는 사람에 마운트됩니다.
그림 6 :. 10X (왼쪽)와 40x (오른쪽) 확대 표시 반짝반짝, 패치 pipettes 패치 pipettes은 필라멘트 및 피펫 팁 표면을 부드럽게하기 위해 광택 화재 borosilicate 유리 모세관 튜브의 생성되었습니다. 피펫 - 풀러 프로그램은 우리의 전기 생리학 설정에서 2 5MΩ의 읽기 준 pipettes를 생성하기 위해 최적화되었다.
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. 그림 7 :; 레코딩 솔루션에 그라운드 전극과 기록 접시에 패치 pipettes 패치 피펫 (오른쪽)과 그라운드 전극 (흰색 화살표 왼쪽).
그림 8 :. 때 목욕 모드에서 패치를 만드는 단계를 설명하는 pClamp10.1 스크린 샷 (A) 스퀘어 웨이브 추적 관찰했다. (B) 패치 모드에서 Gigaohm 도장은 평면 현재 추적의 선도 및 후행 가장자리에 현재의 작은 blips로 표시 피펫 커패시턴스와 함께 광장 파도 추적의 평평화로 연결됩니다. (C) 셀 모드에서 혁신과 잠시 후에, 큰 용량성 과도 볼 수 있습니다.
그림 9 :. 전기 생리학 결과 (왼쪽) 기록 안쪽 전압 - 게이 티드 칼슘 전류는 heterologous 이온 채널의 성공적인 transfection와 표현 (예 : LCav3)를 나타냅니다. (오른쪽) Untransfected 전지은 기록 전류가 없습니다. 세포는 소프트웨어가 세포에서 - 110mV를 개최하고 다음 다시 아래로 - 110mV 잠재적인 개최 250msec를 위해서 - 70mV 단계를 지정 IV 프로토콜의 대상이되었다. 단계가 마지막 단계는 20 뮤직 비디오에까지 단계가 - 70mV, - 60mV 등 수 있도록 10mV로 증가 때마다. 결과 LCav3을 칭했다 L. stagnalis에서 무척추 T - 타입 (Cav3) 전압 - 게이 티드 칼슘 채널 homologue위한 것입니다.
그림 10 : 전극 및 레코딩 솔루션에 microperfusion 연필의 배열 (A) 패치 pipettes은 borosilicate 유리 (오른쪽)에서 만들어진 및 약물 재관류를위한 멀티 배럴 매니폴드 팁 (왼쪽) polyimide.. 하키 스틱이 Microelectrode 홀더 하프 셀에서 개최 등 3M CsCl와 1.5 % 아가로 오스 솔루션 가득 borosilicate 유리의 접지 전극은 (다시) 구부 러. 재관류의 연필 팁 및 기록 microelectrode의 현미경을 통해 (B) 40x 볼 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 자연 과학에서 JDS에 디스커버리 운영 부여에 의해 지원되었다 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC), NSERC 알렉산더 그레이엄 벨 캐나다의 대학원 장학금 (박사) (A. Senatore)을하고 심장과 뇌졸중 재단, 그랜트 # 6284 NA - 인 - 에이드.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech Laboratories | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 - 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Micr–lectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments, Inc. | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige International | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).
- Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
