Summary
Méthode fiable pour très efficace
Abstract
L'expression in vitro et l'enregistrement électrophysiologique de recombinaison canaux ioniques voltage-dépendants dans des cultures de cellules rénales embryonnaires humaines (HEK-293T) est une stratégie de recherche omniprésent. HEK-293T doivent être plaqués sur des lamelles de verre à densité assez faible de sorte qu'ils ne sont pas en contact les uns avec les autres afin de permettre l'enregistrement électrophysiologique sans effets confondants dus au contact avec les cellules adjacentes. Transfectées canaux doivent aussi exprimer avec une grande efficacité à la membrane plasmique des cellules entières d'enregistrement patch clamp des courants détectable au-dessus des niveaux de bruit. Canaux ioniques hétérologue exigent souvent longues périodes d'incubation à 28 ° C après transfection afin de parvenir à l'expression membranaire adéquat, mais il ya augmentation des pertes de cellules lamelle d'adhérence et stabilité de la membrane à cette température. Pour contourner ce problème, nous avons développé une stratégie optimisée pour transfecter et la plaque HEK-293T. Cette méthode nécessite que les cellules transfectées soit à un confluence relativement élevés, et incubés à 28 ° C pendant différentes périodes d'incubation post-transfection pour permettre l'expression d'ions suffisamment de protéines canal. Les cellules transfectées sont ensuite étalées sur des lamelles de verre et incubées à 37 ° C pendant plusieurs heures, ce qui permet la fixation des cellules rigides pour les lamelles et la restabilisation membrane. Les cellules peuvent être enregistrées peu après le placage, ou peuvent être transférées à 28 ° C pour incubation. Nous constatons que l'incubation initiale à 28 ° C, après transfection, mais avant le placage, est la clé pour l'expression efficace des canaux ioniques hétérologue qui normalement n'expriment pas ainsi à la membrane plasmique. Positivement transfectées, les cellules cultivées sont identifiés par co-exprimé eGFP ou EGFP exprimée par un vecteur bicistronique (par exemple pIRES2-EGFP) contenant les ADNc recombinants canal ionique juste en amont d'un site interne d'entrée du ribosome et une séquence de codage eGFP. Cellules entières d'enregistrement patch clamp nécessite un équipement spécialisé, plus la artisanat des électrodes d'enregistrement poli et électrodes de masse en forme de L à partir de verre de borosilicate. La livraison de drogue à l'étude de la pharmacologie des canaux ioniques peuvent être obtenus directement en micropipetage médicaments dans le plat d'enregistrement, ou en utilisant microperfusion ou des systèmes à écoulement par gravité qui produisent des flux ininterrompu de solution médicamenteuse sur les cellules enregistrées.
Protocol
1. Culture de cellules
- Embryonnaires humaines de rein 293T (HEK-293T, Invitrogen) sont cultivés en monocouches adhérentes dans ventilé 25cm 2 flacons (culture de tissus traités; Cellstar; Greiner Bio-One) contenant 6 mL de milieu de Dulbecco Modified Eagles (DMEM; Sigma Aldrich) supplémenté avec 10 % v / v de sérum de veau fœtal (FBS; Sigma Aldrich), le pyruvate de sodium à 1%, et 250 pg / ml de pénicilline / streptomycine à 37 ° C avec 5% de CO 2).
Les cellules sont incubées en CO 2 incubateurs (5% de CO 2) réglé soit 37 ° C ou 28 ° C. Tous les travaux avec des cellules se fait dans une hotte à flux laminaire. - Les cellules sont généralement diviser bi-hebdomadaire, à partir de ~ 90% de confluence, à une dilution de 1:08, les lundis, et 01h12 le jeudi. (Voir Figure 1 pour des images de cellules HEK-293T plaquées à différentes densités)
- Pour le fractionnement, les médias sont retirés de flacons de cellules par aspiration, et les cellules sont détachées par l'application de 1 ml de trypsine (Sigma Aldrich) solution chauffée à 37 ° C dans le ballon inversé. Le flacon est ensuite inversée et bercé par la main de telle sorte que la solution de trypsine se déplace sur les cellules attachées à plusieurs reprises. La trypsine est ensuite rapidement éliminé par aspiration et 250 ul de trypsine est micropipetted dans le ballon qui est à nouveau secoué pour déplacer la solution de trypsine sur les cellules.
- Les flacons sont ensuite incubés dans un incubateur à CO 2 fixé à 37 ° C pendant 3-5 minutes, et une pipette est utilisée pour les cellules en suspension dans 4 ml d'eau tiède complété DMEM. Trypsinisation incomplètes et la suspension causera des amas de cellules et pourraient causer des cellules à croître en hauteur et non pas dans la monocouche destiné. Plus-trypsination peuvent endommager les cellules.
- Pour une scission 01h08, ajouter 500μL de cellules en suspension sont ajoutés à un nouveau flacon contenant 5.5mL de DMEM; pendant une fraction de 1:12 (voir Figure 1), 333μL de cellules sont ajoutées à un nouveau flacon contenant 5.7mL de DMEM . Les flacons sont délicatement mélangés ensuite transféré dans un incubateur à 37 ° C. Au cours de l'incubation de 3-4h à 37 ° C après fractionnement, les cellules vont sédiments et d'adhérer à la fiole. Les cellules initialement regarder autour, mais va aplatir et ont des extensions (pseudopodes) avec plus ferme attachement (figure 1).
Les cellules doivent grandir dans une monocouche adhérente de manière prévisible. Si la croissance cellulaire et l'apparence sont atypiques ou incompatibles, une mauvaise technique ou à la contamination (bactéries / mycoplasmes) devrait être envisagée. La clé de la culture de tissus de succès est la cohérence.
2. La transfection de cellules HEK-293T avec recombinante ADNc canal ionique
- Ici, les ADNc de divers canaux ioniques sont clonés dans le plasmide pIRES2-EGFP (BD Biosciences Clontech), qui permet l'identification de cellules transfectées de façon positive par le biais améliorée protéine verte (eGFP) fluorescents fluorescence. L'EGFP est produite dans des cellules transfectées de la transcription même que l'insert d'ADNc clone, par la traduction initiée à un site d'entrée interne des ribosomes juste en aval de l'insert d'ADNc et en amont de la séquence de codage eGFP (figure 2). Voir figure 3 pour des images de fluorescence HEK-293T, positivement transfectées avec des sous-unités des canaux calciques dans les pIRES2-EGFP constructions.
- Avant la transfection, un flacon totalement confluentes est divisé 01h04 dans un nouveau flacon, et les cellules sont autorisés à fixer à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 pour 3-4 heures (voir Figure 1).
- Après les cellules sont attachés, une stratégie de phosphate de calcium standard de transfection (Cold Spring Harbor protocoles) est utilisé pour introduire des constructions contenant des canaux ioniques et les ADNc sous-unité accessoire dans les cellules HEK. Typiquement, un total de 12μg d'ADN dans 600 uL de solution de transfection ise utilisés par flacon / transfection.
- Après la solution de transfection est pipeté sur les cellules goutte à goutte, le ballon est placé dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit.
- Après la transfection, les cellules sont soigneusement lavées trois fois avec les médias chauds ou tampon phosphate salin (4-5 ml) par pipetage la solution de lavage dans un flacon inversée, puis tournant lentement le flacon debout et bascule dans le ballon de telle sorte que la solution de lavage se déplace sur la cellules. Si ce n'est pas fait avec soin les cellules pourraient detatch et peu seront laissés après les trois étapes de lavage. Le lavage est répété deux fois de plus, puis 6 ml de milieu sont ajoutés dans le ballon et il est incubé à 37 ° C pendant 2 heures, puis transféré dans un incubateur à 28 ° C.
- Transfection réussie de pIRES2-EGFP constructions peuvent être confirmés 1 à 3 jours après la transfection en utilisant un microscope à épifluorescence. Les cellules qui émettent une fluorescence verte lorsqu'elle est exposée à la lumière UV est positivement transfectées et doit exprimer les canaux ioniques et des protéines hétérologues EGFP.
3. Placage des cellules transfectées HEK293T en préparation pour l'enregistrement électrophysiologique
nt "> Différents canaux ioniques exprimer avec des rendements différents à la membrane cellulaire des cellules HEK, et comme tel, le reste de ce protocole requiert une optimisation pour maximiser l'expression en surface de canal permettant l'enregistrement électrophysiologique de succès. Expression des canaux ioniques hétérologues dans des cellules HEK, particulièrement de ceux de sources non mammifères, peuvent présenter certains défis, notamment (1) Les dimensions des protéines de grande envergure nécessitant de longues périodes de traduire et de localiser à la membrane plasmique (2) l'absence ou des dissemblances de pliage et le ciblage des motifs sur la protéine du canal nécessaire dans une mammifères lignée cellulaire (3) les différences de fréquences d'usage des codons d'une espèce à. Tous ces facteurs combinés peuvent entraîner une exigence pour des temps d'incubation est longue à 28 ° C, ce qui garantit l'expression des protéines efficaces et localisation à la surface sans division cellulaire (qui diluerait les les ADNc hétérologues et des protéines). Malheureusement, pour des périodes prolongées d'incubation à 28 ° C conduit au détachement des cellules et stabilité de la membrane de mauvaises décisions d'enregistrement électrophysiologiques difficile. Nous avons décidé de modifier les stratégies de transfection classiques (examiné dans l'affaire Thomas et Smart 2005) afin de minimiser l'incubation à 28 ° C avant d'enregistrer et de maximiser l'expression en surface. Notre méthode nécessite que les cellules transfectées être, incubée pendant une période de 3-7 jours à 28 ° C, puis les cellules sont détachées par trypsinisation et réensemencées sur des lamelles et incubées à 37 ° C qui rééquilibre les membranes et permet d'attachement des cellules sur des lamelles. Les cellules sont alors capables d'enregistrer tout de suite, ou peut-être incubées pour des périodes supplémentaires de temps à 28 ° C. Nous trouvons la replating de cellules sur des lamelles à ce stade ultérieur dans notre méthode est absolument indispensable pour la production de lamelles avec un nombre élevé de canaux d'exprimer, séparer les cellules ci-joint.Nous présentons deux stratégies alternatives, celle que nous préférons utiliser des canaux ioniques et des complexes de canaux ioniques qui ne contiennent pas de grands domaines extracellulaires qui peuvent être vulnérables à la digestion de trypsine (par exemple CAV3 canaux calciques voltage-dépendants; Senatore et Spafford 2010), et un que nous utilisons pour les canaux ioniques qui contiennent de grandes domaines extracellulaires (par exemple de type L canaux calciques voltage-dépendants et leurs sous-unités accessoires;. Senatore, et al 2010).
- Les cellules sont incubées à 28 ° C pendant 2-6 jours pour éviter la division cellulaire et de permettre une accumulation de la protéine traduite. Ce temps d'incubation doit être déterminée empiriquement pour chaque canal ionique, puisque l'expression de surface dépend de facteurs intrinsèques qui dictent la façon dont les canaux 'ARNm naissant et des séquences polypeptidiques interagir avec la machinerie traductionnelle et de la voie de sécrétion, respectivement.
- Avant de placage, des lamelles de verre circulaire (cercles n ° 1 - 0.13 à 0.17mm d'épaisseur; Taille: 12 mm, Fisher Scientific Canada, Ottawa, Ontario) sont recouvertes de poly-L-lysine (Sigma) selon les instructions du fabricant.
- Media est éliminé par aspiration à partir des cellules transfectées, et 1 ml de 37 ° C solution de trypsine (Sigma) est micropipetted dans un flacon inversée (côté pile vers le haut). Le ballon est ensuite retournée doucement à la position verticale pour permettre à la trypsine à courir sur les cellules et le ballon est ensuite ré-inversé et la trypsine éliminé par aspiration. 250 pl de la trypsine est ensuite ajouté au chaud directement sur les cellules et le flacon est incubé à 37 ° C pendant 3-5 minutes jusqu'à ce que le detatch cellules.
- En attendant, la poly-L-lysine lamelles sont placées dans des boîtes de culture de 6mm (3-8 par plat) et 5 ml de milieux de culture chaude est ajoutée à chaque plat.
- Cellules sont remises en suspension avec trypsinisées 4 ml de milieu de culture chaud en aspiration et refoulement ~ 6 fois, puis 250 500μL de cellules en suspension sont micropipetted dans les plats de culture contenant des lamelles. Avant l'addition de cellules, la pointe de la micropipette est utilisé pour pousser vers le bas sur les lamelles afin de s'assurer qu'ils sont au fond du plat.
- Les cellules sont ensuite incubées à 37 ° C pendant 3 heures afin de leur permettre d'adhérer à l'lamelles, puis ils sont transférés à 28 ° C. À ce stade, les cellules sont prêtes pour l'enregistrement électrophysiologiques, qui est idéalement faite avec des cellules séparées, attachés (Fig.3 illustre cellules transfectées avant et après étalement sur des lamelles). Laissant les cellules pendant trop longtemps à 37 ° C entraîne la division cellulaire.
- Préparation des cellules exprimant des canaux / complexes de canaux avec des grands domaines extracellulaires est réalisé dans une grande partie de la même manière, comme indiqué ci-dessus, à l'exception que des lamelles sont incubées à 28 ° C pour un 2-4 jours supplémentaires avant l'enregistrement électrophysiologique est réalisé. Cela permet une ré-accumulation de canaux / canal complexes à la membrane cellulaire après trypsinisation.
4. L'enregistrement électrophysiologique des canaux recombinants dans des cellules HEK-293T
Plusieurs ressources complètes sont disponibles qui décrivent les concepts généraux qui sous-tendent l'enregistrement électrophysiologiques (par exemple, Ogden et Stanfield 1987; Molleman 2003).
4,1 électrophysiologie rig
Un banc d'électrophysiologie typiques (figure 4) comprend un amplificateur (par exemple Axopatch 200B ou 700B Multiclamp amplificateur; Axon Instruments, Union City, CA), un ordinateur PC équipé d'une interface Digidata 1440A convertisseur analogique-numérique en conjonction avec pClamp10.1 logiciel (Molecular Devices, Sunnyvale, Californie), motorisé, manipulateurs double pipette (MPC-385-2, Sutter Instrument Company), un microscope à épifluorescence (Axiovert 40 CFL, Zeiss Canada, Toronto, Ontario) et les systèmes de perfusion (Figures 4 et 5 ). Les vibrations sont limitées par le montage des équipements sur une table de TMC 63-500 isolement série de vibrations (Technical Manufacturing Corporation, Peabody. MA). Stray bruit électrique est limitée en utilisant un 40 "de haut de type II cage de Faraday (TMC) qui entoure les équipements électriques montés sur la table d'isolation des vibrations. Systèmes de contrôle électronique (tels que l'ordinateur et moniteur, amplificateur, convertisseur analogique-numérique de convertisseur, manipulateur motorisé et Système de contrôle ValveLink perfusion) sont montés à l'extérieur de la cage de Faraday pour une grille métallique autoportante électriques (Hammond Manufacturing, Guelph, en Ontario). Tout le matériel électrique est fondée à un distributeur de cuivre et branché sur une isolation de qualité médicale tranformer (1800W, Tripp Lite UL60601-1) qui assure l'isolation de ligne, un terrain uniforme et de suppression des surtensions.
4.2 Pipettes Patch
Tubes en verre borosilicaté capillaire avec filament (OD 1.5mm, OD 0.86mm, 15cm de longueur; BF150-86-15; Sutter Instrument Company) sont réduits de moitié et inséré dans un Flaming / Brown Micropipette Extracteur modèle P-97 (Sutter Instrument Company) . Un programme de la pipette-extracteur est optimisée de façon constante avec les pipettes résistances entre 2 à 5MΩ de l'électrode à la terre (après polissage feu; Fig.6) Pipettes sont individuellement polies au feu pour lisser les surfaces pointe de la pipette qui permet d'assurer l'étanchéité contre les membranes cellulaires ( Micro Forge MF-830; Narishige, le Japon, figure 6). Micropipettes sont montés sur le headstage avec un support spécialisé (1-HL-U; Molecular Devices, Sunnyvale en Californie).
4,3 électrodes de masse
Les tubes en verre borosilicate utilisé pour faire des pipettes de patch sont également utilisés pour fabriquer des électrodes de référence. Les tubes sont coupés 15cm de long en 3 morceaux. Avec 2 à pointe fine pince, les tubes sont maintenus dans une flamme du bec Bunsen jusqu'à ce que le verre devient malléable et le tuyau peut être plié à un «L» ou «crosse de hockey" forme avec un angle de 90o. Alors que les tubes de verre sont encore chauds, une extrémité est immédiatement immergé dans un hot CsCl 3M et 1,5% de solution d'agarose qui est aspiré dans le tube par capillarité. Une fois une électrode de référence est complètement rempli de solution, il est placé dans un bécher d'eau froide. Après que toutes les électrodes de référence sont remplis, ils sont individuellement essuyés avec Kimwipes pour enlever supplémentaires agarose de l'extérieur et sont immergés dans une solution 3M de CsCl. Pour l'enregistrement électrophysiologiques, les électrodes de référence sont détenues dans un porteur microélectrodes Demi-cellules (90 F Titulaire Pellet 1.5mm; # MEH3RF15; World Precision Instruments Inc, Sarasota en Floride) rempli de 3M CsCl solution. (Voir Figure 7 pour l'illustration d'une électrode de masse dans une solution de bain)
4.4 des solutions d'enregistrement d'électrophysiologie
Différents types de canaux ioniques voltage-dépendants ont besoin de solutions d'enregistrement différents selon la perméabilité aux ions / sélectivité. Pour les canaux calciques voltage-dépendants, les cellules sont généralement baigné dans des solutions externes contenant soit de baryum ou de calcium à des concentrations différentes. Par exemple, l'enregistrement électrophysiologique de l'invertébré CAV3 canaux calciques voltage-dépendants (LCav3) peut être effectuée en utilisant une solution externe contenant 5mM de CaCl 2, 166mm tétraéthylammonium (TEA-Cl), HEPES 10 mM d'un pH ajusté à 7,4 avec de la TEA-OH. Pipettes de patch sont remplies d'une solution interne de 125mm de CsCl, 10 mM EGTA, 2 mM CaCl 2, MgCl 2 1 mM, 4mm MgATP, 0.3mm Tris-GTP, et HEPES 10 mM d'un pH de 7,2 (Senatore et Spafford, 2010). Les invertébrés de type L des canaux calciques voltage-dépendants (LCav1) peuvent être enregistrées à l'aide d'une solution externe contenant du baryum comme porteur de charge (15mm BaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM HEPES, 40 mM de TEA-Cl, 72.5mm CsCl, Glucose 10 mM, avec le pH ajusté à 7,2 avec de la TEA-OH) et une solution interne contenant 108mm Cs-méthanesulfonate, 4mm MgCl2, 9mm EGTA, HEPES 9mm, pH ajusté à 7,2 avec CsOH (Senatore et al., 2010).
4.5 Enregistrement de cellules entières
- Une lamelle contenant des cellules transfectées (exprimant les canaux ioniques hétérologues ou de complexes de canaux ioniques) est transféré à une boîte de Pétri en plastique contenant 3 ml ~ 35mm de solution d'enregistrement externe. Le volume de solution d'enregistrement doit être mesurée avec précision lors de la réalisation des expériences de drogue, où un montant connu de la drogue doivent être ajoutées au plat avec une micropipette. Enregistrements électrophysiologiques sont généralement effectuées à la température ambiante, bien que le chercheur peut souhaiter modifier cette température en fonction de l'expérience.
- Les cellules sont visualisées grâce à un microscope à épifluorescence et une isolée, positivement transfectées, adhérent cellule verte est centrée au milieu du champ de vue.
- La pipette de patch est descendue dans la solution du bain à l'aide d'un micromanipulateur, qui complète le circuit entre l'électrode dans la pipette de patch et l'électrode de référence. En mode de bain, le logiciel pClamp10.1 provoque l'amplificateur pour générer de petites étapes de tension répétant entre la pipette et l'électrode de référence, et affiche le courant résultant comme une trace d'ondes carrées (figure 8A). Cette trace d'ondes carrées doit être mis à zéro en utilisant la pipette compensée sur l'amplificateur avant le patcher une cellule. La résistance est mesurée par la pipette du logiciel pClamp10.1, et devrait être dans les 2-5MΩ.
- En mode de bain, la pipette est amené dans la proximité de la cellule, qui peut être visualisée comme des fluctuations rapides de la trace onde carrée, puis une petite quantité d'aspiration est appliquée à la pipette de patch pour former un joint gigaohm entre la pipette et la membrane (provoque une plate complète en ligne de la trace d'ondes carrées; figure 8B).
- Le programme est alors commuté en mode patch, et la capacité pipette (visible en tant que minuscules blips du courant sur les bords d'attaque et de fuite des traces plats actuels; figure 8B) est compensé par la capacité de compensation pipette sur l'amplificateur.
- Une petite quantité, mais forte de l'aspiration est appliquée à la rupture de la membrane dans le patch et de permettre l'accès de l'électrode à l'intérieur de la cellule. Rupture des membranes réussie est indiquée par l'apparition de grandes transitoires capacitifs aussi sur le bords avant et arrière de la trace vague actuelle (figure 8C). Une fois percée a été réalisée, le programme est mis en mode cellulaire et toute indemnité capacité de la cellule est ajustée sur l'amplificateur pour enlever les transitoires capacitifs. Il ya un retard de quelques minutes pour permettre l'équilibrage de la solution d'enregistrement intracellulaire dans la cellule avant l'enregistrement.
- Tension commandes sont générées et les données sont acquises à l'aide d'un ordinateur équipé d'une interface Digidata 1440A convertisseur analogique-numérique en conjonction avec pClamp10.1 logiciel. Unique protocoles voltage sont écrites pour chaque expérience, et elles sont utilisées pour enregistrer les courants des canaux ioniques à partir des cellules transfectées. La figure 9 illustre les courants de calcium enregistrés à partir d'une cellule HEK-293T exprimant la invertébrés LCav3 canaux calciques voltage-dépendants. La cellule a eu lieu à une tension de 110mV-et depolarisations incrémentielles entre-70mV et +20 mV ont été prises pour susciter des courants de calcium vers l'intérieur.
- Courants enregistrés sont filtrés à 10 kHz en utilisant un passe-bas du filtre de Bessel et numérisés à une fréquence d'échantillonnage de 2 kHz. Seuls les enregistrements avec des fuites minimes (<10%) sont utilisées pour l'analyse, et hors ligne de fuite soustraction est effectuée en utilisant les Clampfit 10,1 logiciel.
4.6 études sur les médicaments des cellules enregistrées
Les médicaments peuvent être directement à la pipette dans le plat en cours d'enregistrement. Concentration de la drogue peut être calculé si le volume de médicament ajouté et le volume de solution de bain sont connues. Des quantités limitées de coûteux ou de drogue peuvent également être ajoutés par microperfusion partir d'un collecteur multi-baril de polyimide crayon perfusion avec une pointe de 250 microns amovibles, utilisant soit une Smartsquirt huit canaux de pression de perfusion système de micro (AutoMate scientifique) ou un système à écoulement par gravité exploités par Téflon vannes et Valvelink8 contrôleurs de vanne (AutoMate scientifique; voir la Figure 5 pour les configurations système de perfusion). Débits de systèmes microperfusion sont fixés à 0,1 ml par minute dans un flux de quitter le crayon de perfusion de 400 microns de la cellule enregistrée. La distance de la pointe du crayon de perfusion de la pointe de l'électrode d'enregistrement doivent être compatibles à partir de patch à patcher; La figure 10 illustre une distance suggéré visibles à un grossissement de 40x. De fournir des débits adéquats perfusion saturante de la cellule enregistrée. Avant une expérimentation de drogues est effectuée à l'aide microperfusion, les cellules sont équilibrées avec l'microperfusion de solution de bain de contrôle dans un flux continu. Une interruption minimale du flux est évitée lors de l'expérience par la commutation rapide du bain de contrôle, de drogue ou la solution de lavage. Aspiration montées sur le bord du plat enregistrement peut être utilisé to retirer débordement des solutions, au moyen de l'aspiration manuelle avec une seringue ou un dispositif utilisant une pompe péristaltique entraîné (par exemple MINISTAR miniature DC Pompe péristaltique, Instruments de précision du monde). Des précautions doivent être prises depuis la perfusion extrêmement rapide induit des forces de cisaillement qui peuvent modifier le cours de calcium (Peng et al. 2005), peut laver la cellule en cours d'enregistrement, et épuise le réservoir de médicament trop rapidement.
Directement dans le plat de pipetage vs systèmes de perfusion
| Pipetage direct | Micro système de perfusion | Système de perfusion par gravité | |
| Médicaments volume nécessaire | Modérée | Faible | Haute |
| L'habileté technique | Faible | Medium | Medium |
| Coût de l'équipement | Faible | Importants | Importants |
| Temps quotidien d'installation et de nettoyage | Aucun | 20 + minutes | 20 + minutes |
| La contamination de l'équipement | Aucun | Oui | Oui |
| Dépannage | Facile | Complexe | Complexe |
| Médicaments garanti dans le plat | Oui | Aucun | Aucun |
| Perdre cellule avec plus de drogue | Oui | Oui | Oui |
| Réduire considérablement concentré de drogue. par un lavage | Difficiles | Simples | Simples |
| Facilité de faire une courbe de réponse à doses multiples | Moins optimale | Simples | Simples |
| La reproductibilité des résultats | OK - dépend de l'emplacement du pippeting | Bonne | Bonne |
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Discussion
Etre capable d'enregistrer la cellule entière courants en utilisant les protocoles décrits et les solutions indique que la transfection a été un succès et que les canaux souhaités ioniques voltage-dépendants ou les complexes de canaux ioniques sont présents en quantités significatives à la membrane cellulaire. Si les cellules transfectées de façon positive (c.-vert fluorescent) mais pas les courants enregistrable, un délai supplémentaire à 28 ° C peut être nécessaire pour permettre la protéine du canal pour être convenablement emballés et insérée dans la membrane cellulaire. Notez que l'incubation prolongée à 28 ° C provoque des cellules à se détacher des lamelles, et les membranes déstabiliser et d'accumuler des débris de cellules mortes, ce qui rend l'enregistrement patch clamp plus difficile. Toutes les heures suggérées dans le présent protocole ont été optimisés pour nos canaux en particulier. D'autres canaux et leurs sous-unités peuvent nécessiter des temps d'incubation plus longues ou plus courtes, et notre protocole peut encore être ajustée au besoin. Pour certaines chaînes efficacité de la transfection pauvres (c'est à dire moins cellules fluorescentes et inférieures d'intensité de fluorescence par cellule) produit de meilleurs résultats que efficacement transfectées, les cellules fortement fluorescentes. Si les cellules sont fluorescentes, mais pas les courants enregistrables, les points de dépannage à considérer incluent: un manque de protéine accessoire (s); mauvais mélange des réactifs de transfection; solutions d'enregistrement sous-optimale, et la mutation / recombinaison de canal ou le canal sous-unité des constructions d'ADNc produisant mal plié ou non exprimer des canaux.
Figure 1: rénales embryonnaires humaines 293T (HEK-293T) sont cultivés en monocouches adhérente à 37 ° C dans les incubateurs à CO2 (5% de CO2) dans des flacons ventilés 25cm2 à 90% de confluence et diviser à 1:12, 1:8 et 1:4 dilutions. Les cellules sont généralement diviser bi-hebdomadaire, d'une confluence ~ 90%. Afin d'assurer une même ~ 90% de confluence au fractionnement, les cellules sont réparties dans une dilution 1:08 le lundi et 01h12 le jeudi. Avant la transfection, un flacon totalement confluentes est divisé 01h04 dans un nouveau flacon, et les cellules sont autorisés à fixer à 37 ° C dans un incubateur à CO2 pour 3-4 heures.
Figure 2: Stratégie pour l'expression hétérologue des canaux ioniques dans des cellules HEK-293T (à gauche) ADNc de canaux ioniques sont clonés dans le site de clonage multiple du plasmide pIRES2-EGFP.. (À droite) La transfection de ces constructions dans les résultats des cellules HEK dans la production de molécules d'ARNm contenant la séquence codante du canal ionique (rouge) juste en amont d'un site interne d'entrée du ribosome (IRES; bleu) et la séquence de codage eGFP (vert). Les canaux ioniques sont traduits et conduits à la membrane cellulaire via l'ER et le système endomembranaire, tandis eGFP est traduit et conservé dans le cytoplasme.
Figure 3:. Transfection et l'expression des ADNc hétérologue des canaux ioniques dans des cellules HEK-293T, et le placage des cellules sur des lamelles pour l'enregistrement électrophysiologiques (A) (haut) HEK-293T incubées à 28 C, soit quatre jours après la transfection avec le LCav3 canaux calciques hébergé dans le pIRES2-EGFP vecteur d'expression mammifère CMV. (En bas) Les cellules-dessus trypsinisées et étalées sur des lamelles en verre, isolé pour l'enregistrement électrophysiologiques. Microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC).
Figure 4:. Typique configuration électrophysiologique rig rig enregistrement électrophysiologique des composants d'enregistrement comprennent un amplificateur (A), un ordinateur personnel (PC), Digidata 1440A interface de convertisseur analogique-numérique (C), motorisé, manipulateurs double pipette (PM), un microscope à épifluorescence (M), systèmes de perfusion (P), TMC 63-500 table de l'isolement série de vibrations (VT), 40 grands de type II cage de Faraday (CF), et une autoportante métallique 19, porte électrique (R).
Figure 5: systèmes de perfusion (A) Un système à écoulement par gravité exploité en utilisant les vannes téflon et Valvelink8 contrôleurs.. (B) Huit Smartsquirt la pression de perfusion système de micro canaux. Astuce Manifold Multi-Barrel soit le système de perfusion est monté sur un manipulateur motorisé.
Figure 6:. Poli pipettes de patch, représenté à 10x (à gauche) et 40x (à droite) un grossissement Patch pipettes ont été générés à partir des tubes en verre borosilicate capillaire avec filament et polies au feu pour lisser les surfaces pointe de la pipette. Un programme de la pipette-extracteur a été optimisé pour générer des pipettes qui a donné une lecture de la 2-5MΩ dans notre électrophysiologie set-up.
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. Figure 7: électrode de masse et des pipettes de patch dans le plat d'enregistrement Patch pipette (à droite) et électrode de masse (à gauche; flèche blanche) en solution d'enregistrement.
Figure 8:. PClamp10.1 captures d'écran illustrant les étapes de fabrication d'un patch (A) de traces d'ondes carrées observés lorsqu'il est en mode de bain. (B) Un sceau gigaohm en mode correctif conduit à un aplatissement de la courbe à onde carrée avec une capacité de pipettes visibles blips infime de courant sur les bords d'attaque et de fuite des traces plats actuels. (C) Après la percée et en mode cellulaire, grande transitoires capacitifs sont vus.
Figure 9:. Électrophysiologie des résultats (à gauche) enregistrables l'intérieur des courants calciques voltage-dépendants indique transfection réussie et l'expression de canaux ioniques hétérologues (par exemple LCav3). (Droite) cellules non transfectées sont pas courants enregistrable. Les cellules ont été soumis à un protocole IV qui précise que le logiciel maintenir la cellule au-110mV et ensuite étape à-70mV pour 250 ms, puis redescendre à-110mV tenant potentiels. Chaque fois que l'étape augmente de 10mV afin que les mesures sont à 70mV etc,-60mV jusqu'à la dernière étape consiste à 20 mV. Les résultats sont pour un invertébré de type T (CAV3) voltage-dépendants homologue des canaux calciques de L. stagnalis appelé LCav3.
Figure 10: Disposition des électrodes et un crayon dans la solution d'enregistrement microperfusion (A) Pipettes patch conçu à partir de verre de borosilicate (à droite) et de polyimide pointe de multiples multi-baril pour perfusion de médicaments (à gauche).. Électrode de masse (retour) en verre de borosilicate rempli de 3M CsCl et 1,5% solution d'agarose courbée comme un bâton de hockey au lieu Titulaire microélectrodes demi-cellules. (B) pour voir à travers un microscope 40x sur la pointe du crayon de perfusion et de microélectrodes d'enregistrement.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de fonctionnement découverte à partir du JDS sciences naturelles et en génie (CRSNG) du Canada, du CRSNG Alexander Graham Bell Canada Bourses d'études supérieures (doctorat) (à A. Senatore) et la Fondation des maladies du cœur, Grant -in-aid NA # 6284.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech Laboratories | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 - 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Micr–lectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments, Inc. | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige International | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).
- Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
