Summary
Método confiável para altamente eficiente
Abstract
A expressão in vitro e em gravação eletrofisiológicas de recombinante dos canais de íons nas culturas de células embrionárias do rim (HEK-293T) é uma estratégia de pesquisa onipresente. HEK-293T células devem ser semeados em lamínulas de vidro com uma densidade baixa o suficiente para que eles não estão em contato uns com os outros, a fim de permitir a gravação eletrofisiológicas sem efeitos de confusão devido ao contato com as células adjacentes. Canais transfectadas também deve expressar com alta eficiência na membrana plasmática de células inteiras de gravação patch clamp de correntes detectável acima dos níveis de ruído. Canais iônicos heteróloga muitas vezes exigem longos períodos de incubação a 28 ° C após a transfecção, a fim de alcançar expressão membrana adequada, mas há um aumento na perda de células-lamela aderência e estabilidade da membrana, a esta temperatura. Para contornar esse problema, desenvolvemos uma estratégia otimizada para células HEK-293T transfecção e placa. Este método requer que as células transfectadas ser em uma confluência relativamente alto, e incubados a 28 ° C por diferentes períodos de incubação pós-transfecção para permitir a adequada expressão da proteína de canal iônico. Células transfectadas são então banhado em lamínulas de vidro e incubados a 37 ° C por várias horas, que permite a penhora de células rígidas para as lamelas e restabilização membrana. As células podem ser gravadas logo após o plaqueamento, ou podem ser transferidos para 28 ° C para a incubação mais. Nós achamos que a incubação inicial a 28 ° C, após a transfecção, mas antes do plaqueamento, é a chave para a expressão eficiente de canais de íons heteróloga que normalmente não expressam bem na membrana plasmática. Positivamente transfectadas, as células cultivadas são identificados por co-expressas ou eGFP eGFP expressa a partir de um vector bicistronic (por exemplo, pIRES2-EGFP) contendo o canal iônico recombinante cDNA logo acima de um local de entrada interna ribossomo e uma seqüência de codificação eGFP. Whole-cell patch clamp gravação requer equipamentos especializados, além da elaboração de eletrodos de registro polido e eletrodos em forma de L chão de vidro de borosilicato. A entrega da droga para estudar a farmacologia dos canais iônicos podem ser alcançados diretamente micropipetting drogas no prato de gravação, ou usando microperfusão ou sistemas de fluxo por gravidade que produzem fluxos ininterruptos de solução de drogas sobre as células gravadas.
Protocol
1. Cultura de células
- Renais embrionárias humanas 293T células (HEK-293T, Invitrogen) são cultivadas em monocamadas aderente em ventilada 25 centímetros dois frascos (cultura de tecidos tratados; Cellstar; Greiner Bio-One), contendo 6ml de Modified Dulbecco Eagles Medium (DMEM; Sigma Aldrich) suplementado com 10 % v / v soro fetal bovino (FBS; Sigma Aldrich), piruvato de sódio a 1%, e 250 mcg / mL de penicilina / estreptomicina a 37 ° C com 5% CO 2).
As células são incubadas em incubadoras de CO 2 (5% CO 2) definido como 37 ° C ou 28 ° C. Todo o trabalho com células é feito em uma capela de fluxo laminar. - As células são tipicamente dividida bi-semanais, de ~ 90% confluência, em uma diluição 1:08 às segundas-feiras, e 01:12 às quintas-feiras. (Veja a Figura 1 para imagens de células HEK-293T banhado em diferentes densidades)
- Para a divisão, a mídia é removido frascos de células por aspiração, e as células são separadas, aplicando 1 ml de solução de tripsina (Sigma Aldrich) aquecidas a 37 ° C para o frasco invertido. O balão é posteriormente invertida e suavemente embalado pela mão de tal forma que a solução de tripsina se move sobre as células anexada várias vezes. A tripsina é então rapidamente removido por aspiração e 250 mL de tripsina é micropipetted para o balão que mais uma vez bombou para mover a solução de tripsina sobre as células.
- Frascos são então incubadas em incubadora de CO 2 set a 37 ° C por 3-5 minutos, e uma pipeta é usado para suspender as células em 4 ml de DMEM suplementado quente. Tripsinização incompleta e suspensão fará com que aglomerados de células e pode levar as células a crescer para cima e não na monocamada pretendido. Mais de tripsinização-pode danificar as células.
- Por uma fração de 1:8, adicionar 500μL de células em suspensão são adicionados a um frasco contendo novas 5.5mL de DMEM; por uma fração de 1:12 (ver Figura 1), 333μL de células são adicionados a um frasco contendo novas 5.7mL de DMEM . Frascos são cuidadosamente misturadas, em seguida, transferido para a 37 ° C incubadora. Durante a incubação de 3 4h a 37 ° C após a divisão, as células de sedimento e aderir ao balão. As células inicialmente olhar em volta, mas vai achatar e possuem extensões (pseudópodos), com mais firme apego (Figura 1).
As células devem crescer em uma monocamada aderente de uma maneira previsível. Caso o crescimento celular e aparência ser atípica ou inconsistente técnica, pobres ou contaminação (bactérias / micoplasma) deve ser considerada. A chave para a cultura de tecidos bem sucedida é a consistência.
2. Transfecção de HEK-293T com proteína recombinante cDNAs de canal iônico
- Aqui, cDNAs de vários canais de íons são clonados no plasmídeo pIRES2-EGFP (BD Biosciences Clontech), que permite a identificação de células transfectadas positivamente reforçada através de fluorescência proteína verde fluorescente (EGFP). O eGFP é produzido em células transfectadas da transcrição igual ao inserir clonado cDNA, através da tradução iniciada em um local de entrada interna ribossomo a jusante da inserção de cDNA ea montante da seqüência eGFP codificação (Figura 2). Veja a Figura 3 para imagens fluorescentes de HEK-293T, positivamente transfectadas com subunidades dos canais de cálcio em pIRES2-EGFP construções.
- Antes de transfecção, um frasco completamente confluentes é dividido 1:04 em um frasco novo, e as células podem se conectar a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 para 3-4 horas (ver Figura 1).
- Depois que as células estão ligados, um padrão de cálcio estratégia de transfecção fosfato (Cold Spring Harbor protocolos) é usado para introduzir construções contendo canal iônico e cDNAs subunidade acessório para dentro das células HEK. Tipicamente, um total de 12μg de DNA em 600 mL de solução de transfecção ise utilizada por frasco / transfecção.
- Após a solução de transfecção é pipetado sobre as células gota a gota, o frasco é colocado em uma incubadora de 37 ° C durante a noite.
- Transfecção seguintes, as células são cuidadosamente lavadas três vezes com a mídia quente ou tampão fosfato (mL 4-5) pipetando a solução de lavagem em um frasco invertido e, em seguida, lentamente, transformando o frasco na vertical e balançando o balão de modo que a solução de lavagem se move sobre o células. Se isso não for feito com cuidado as células poderiam detatch e poucos serão deixados após as três etapas de lavagem. A lavagem é repetida mais duas vezes, em seguida, 6 mL dos meios de comunicação são adicionados ao balão e é incubada a 37 ° C durante 2 horas, em seguida, transferido para a 28 ° C incubadora.
- Bem sucedida de transfecção pIRES2-EGFP construções podem ser confirmadas 1 a 3 dias após transfecção utilizando um microscópio de epifluorescência. Células que apresentam fluorescência verde quando exposto à luz UV são positivamente transfectadas e devem expressar a canal iônico e proteínas heterólogas eGFP.
3. Chapeamento de células transfectadas HEK293T em preparação para a gravação eletrofisiológicas
nt "> ion Diferentes canais de expressar com diferentes eficiências na membrana celular das células HEK e, como tal, o restante deste protocolo exige alguma otimização para maximizar a expressão de canais de superfície permitindo a gravação eletrofisiológicos de sucesso. Expressão heteróloga de canais iônicos em células HEK, particularmente daqueles de não-mamíferos fontes, pode apresentar alguns desafios, incluindo (1) tamanhos grande proteína que exigem longos períodos de traduzir e localizar para a membrana plasmática (2) ausência ou diferenças de dobrar e definindo motivos na proteína de canal necessários em um mamífero linha celular (3) as diferenças nas freqüências de uso de códon de espécie para espécie. Todos esses fatores combinados pode resultar em uma exigência para os tempos de incubação longo a 28 ° C, o que garante a expressão da proteína eficaz e localização de superfície, sem a divisão celular (o que diluiria a os cDNAs heteróloga e proteínas). Infelizmente, por períodos prolongados de incubação a 28 ° C leva ao descolamento da membrana celular e estabilidade pobres fazendo gravação eletrofisiológicas difícil. Decidimos modificar estratégias convencionais de transfecção (revisto em Thomas e Smart 2005), a fim de minimizar a incubação a 28 ° C antes de gravar e para maximizar a expressão de superfície. Nosso método requer que as células transfectadas ser, incubados por um período de 3-7 dias a 28 ° C, em seguida, as células são separadas por tripsinização e replated em lamínulas e incubados a 37 ° C que restabilizes membranas e permite a forte ligação de células em lamínulas. células são, então, capaz de ser registrado imediatamente, ou pode ser incubados por períodos de tempo adicional a 28 ° C. Encontramos o repique das células em lamínulas nesta fase posterior em nosso método a ser absolutamente essencial para a produção de lamelas com elevado número de canal de expressão, separar as células em anexo.Nós apresentamos duas estratégias alternativas, uma que prefere usar para canais de íons e complexos de canal iônico, que não contêm grandes domínios extracelulares que podem ser vulneráveis a tripsina digestão (por exemplo, Cav3 dos canais de cálcio; Senatore e Spafford 2010), e um que usamos para canais iônicos que contêm grandes domínios extracelulares (por exemplo, L-tipo dos canais de cálcio e suas subunidades acessórias;. Senatore, et al 2010).
- As células são incubadas a 28 ° C por 2-6 dias para evitar a divisão celular e para permitir a acumulação de proteína traduzida. Este tempo de incubação devem ser determinadas empiricamente para cada canal iônico, já que a expressão de superfície é dependente de fatores intrínsecos que ditam como os canais de 'mRNA nascente e seqüências polipeptídicas interagem com as máquinas de translação e da via de excreção, respectivamente.
- Antes de chapeamento, lamínulas de vidro circular (Círculos No. 1 - 0,13 a 0,17 milímetros de espessura; Tamanho: 12 mm, Fisher Scientific Canadá, Ottawa, Ontario) são revestidas com poli-L-lisina (Sigma), conforme instruções do fabricante.
- Mídia é removido por aspiração das células transfectadas, e 1 mL de 37 ° C solução de tripsina (Sigma) é micropipetted em um frasco invertido (lado célula para cima). O balão é então invertido suavemente para a posição vertical para permitir que a tripsina a correr sobre as células, eo frasco é então re-invertido e da tripsina removida por aspiração. 250 L de tripsina quente é então adicionado diretamente sobre as células eo frasco é incubada a 37 ° C por 3-5 minutos até que o detatch células.
- Enquanto isso, poli-L-lisina revestido lamínulas são colocados em placas de cultura de 6 milímetros (3-8 por prato) e 5 mL de meios de cultura quente é adicionado a cada prato.
- Tripsinizados células são ressuspendidas com 4mL de meios de cultura morna por pipetagem cima e para baixo ~ 6 vezes, e depois 250-500μL de células ressuspenso são micropipetted para os pratos de cultura contendo lamínulas. Antes da adição de células, a ponta da micropipeta é usado para empurrar para baixo sobre as lamelas para garantir que eles estão no fundo do prato.
- As células são então incubados a 37 ° C por 3 horas, que lhes permitam aderir às lamínulas, e então eles são transferidos para 28 ° C. Neste ponto, as células estão prontos para a gravação eletrofisiológicas, que deve ser feito preferencialmente com separar-anexado células (Fig.3 ilustra células transfectadas antes e após o plaqueamento em lamelas). Deixando as células por muito tempo a 37 ° C irá resultar na divisão celular.
- Preparação de células que expressam canais / complexos de canal com grandes domínios extracelulares é realizado em quase da mesma maneira como indicado acima, com a ressalva de que as lamínulas são incubados a 28 ° C por mais 2-4 dias antes da gravação eletrofisiológico é realizado. Isto permite uma re-acumulação de canais / canais complexes na membrana celular após tripsinização.
4. Gravação eletrofisiológica de canais recombinantes em células HEK-293T
Vários recursos estão disponíveis abrangente que descrevem os conceitos gerais subjacentes a gravação eletrofisiológico (por exemplo, Ogden e Stanfield, 1987; Molleman 2003).
4,1 Eletrofisiologia rig
Um típico eletrofisiologia rig (Figura 4) inclui um amplificador (por exemplo, Axopatch 200B ou 700B Multiclamp amplificador; Instruments Axon, Union City, CA), um computador PC equipado com uma interface conversor Digidata 1440A analógico para digital em conjunto com pClamp10.1 software (dispositivos Molecular, Sunnyvale, California), motorizado, dual manipuladores pipeta (MPC-385-2, Sutter Instrument Company), um microscópio de epifluorescência (Axiovert 40 CFL, Zeiss Canadá, Toronto, Ontario) e sistemas de perfusão (Figuras 4 e 5 ). Vibrações são limitadas pela montagem do equipamento em uma mesa 63-500 série de isolamento de vibração TMC (Technical Manufacturing Corporation, Peabody. MA). Ruído elétrico Stray é limitada usando um 40 "de altura Tipo II Faraday Cage (TMC) em torno do equipamento elétrico montado na mesa de isolamento de vibração. Eletrônico sistemas de controle (como computador e monitor, amplificador, analógico-digital conversor, manipulador motorizados e ValveLink sistema de controle de perfusão) são montados fora da gaiola de Faraday para uma grelha de metal free-standing elétrica (Hammond Manufacturing, Guelph Ontario). Todos os equipamentos elétricos é aterrado a um distribuidor de cobre e conectado a uma Medical Grade de isolamento tranformer (1800W, Tripp Lite UL60601-1) que fornece isolamento linha, um terreno consistente e supressão de surtos.
4,2 pipetas patch
Tubos de vidro de borosilicato com filamento capilar (OD, OD 1,5 milímetros 0,86 milímetros, 15 centímetros de comprimento; BF150-86-15; Sutter Instrument Company) são cortadas ao meio e inserido em um Flaming / Brown Micropipeta Puller modelo P-97 (Sutter Instrument Company) . Um programa de pipeta-extrator é otimizado para gerar consistentemente pipetas com resistências entre 2 a 5MΩ de eletrodo para a terra (após o polimento fogo; Fig.6) Pipettes são individualmente fogo polidas para suavizar as superfícies ponta da pipeta que permite a selagem estanque contra as membranas celulares ( Micro Forge MF-830; Narishige, Japão, Figura 6). Micropipetas são montados no headstage com um suporte especializado (1-HL-U; dispositivos moleculares, Sunnyvale Califórnia).
4,3 eletrodos terra
Os tubos de vidro de borosilicato utilizado para fazer pipetas correção também são usados para fazer eletrodos de referência. Os tubos de 15cm de comprimento é cortado em três pedaços. Com 2 pinças de ponta fina, os tubos são mantidos em uma chama bico de Bunsen até que o vidro se torna maleável e do tubo pode ser dobrado para um "L" ou "taco de hóquei" forma com um ângulo de 90o. Enquanto os tubos de vidro são ainda quente, uma final é imediatamente imerso em um hot 3M CsCl e 1,5% agarose solução que é atraído para dentro do tubo por ação capilar. Uma vez que um eletrodo de referência é completamente preenchida com a solução, ele é colocado num copo de água fria. Depois de todos os eletrodos de referência são preenchidas, elas são individualmente limpo com Kimwipes para remover agarose extras a partir do exterior e estão submersos em uma solução de CsCl 3M. Para a gravação eletrofisiológico, os eletrodos de referência são mantidas em um Detentor microeletrodos Half-Cells (Titular 90 F Pellet 1,5 mm; # MEH3RF15; Mundial Precision Instruments Inc., Sarasota Florida) preenchido com solução de CsCl 3M. (Veja a Figura 7 para ilustração de um eletrodo terra na solução do banho)
4,4 gravação soluções Eletrofisiologia
Diferentes tipos de canais voltagem-dependentes de íons requerem soluções de gravação diferentes, dependendo da permeabilidade de íons / seletividade. Para os canais de cálcio voltagem-dependente, as células são normalmente banhadas em soluções externas contendo um ou outro de bário ou de cálcio em várias concentrações. Por exemplo, a gravação eletrofisiológica da invertebrados dos canais de cálcio voltagem-dependentes Cav3 (LCav3) pode ser realizada utilizando uma solução externa contendo 5mM CaCl 2, 166mm tetraethylammonium (TEA-Cl), HEPES 10 mM com pH ajustado para 7,4 com TEA-OH. Pipetas patch são preenchidos com uma solução interna de 125mm CsCl, EGTA 10 mM, CaCl 2 2mM, MgCl 2 1 mM, 4mm MgATP, 0.3mm Tris-GTP, e HEPES 10mM com um pH de 7,2 (Senatore e Spafford, 2010). Os invertebrados tipo L-canais de cálcio voltagem-dependentes (LCav1) podem ser gravados utilizando uma solução externa contendo bário como o portador de carga (15mm BaCl2, 1mM MgCl 2, 10mM HEPES, 40mm Glucose TEA-Cl, 72.5mM CsCl, 10mM, com o pH ajustado para 7,2 com TEA-OH) e uma solução interna contendo 108mm Cs-metanossulfonato, 4 mM MgCl 2, EGTA 9mm, 9mm HEPES, pH ajustado para 7,2 com CsOH (Senatore et al., 2010).
4,5 Gravação de células inteiras
- A lamela contendo células transfectadas (expressando canais iônicos heteróloga ou complexos de canal iônico) é transferido para um prato de plástico 35 milímetros petri contendo ~ 3mL de solução de gravação externa. O volume de solução de gravação deve ser medido com precisão ao realizar experiências com drogas, onde quantidades conhecidas de drogas devem ser adicionados ao prato com uma micropipeta. Gravações eletrofisiológicas são tipicamente feito à temperatura ambiente, embora o pesquisador pode querer mudar esta temperatura dependendo do experimento.
- Células são visualizadas através de um microscópio de epifluorescência, e um isolado, positivamente transfectadas, célula verde aderente é centrado no meio do campo de visão.
- A pipeta patch é rebaixada para a solução do banho usando um micromanipulador, que completa o circuito entre o eletrodo na pipeta de patch eo eletrodo de referência. Enquanto estiver no modo de banho, o software faz com que o amplificador pClamp10.1 para gerar pequenos passos tensão repetindo entre a pipeta eo eletrodo de referência, e exibe a corrente resultante como um traço de onda quadrada (Figura 8A). Esse traço de onda quadrada deve ser zerado por meio da pipeta compensar no amplificador antes de remendar uma célula. A resistência da pipeta é medido pelo software pClamp10.1, e deve ser dentro de 2-5MΩ.
- Enquanto estiver no modo de banho, a pipeta é trazido para perto da célula, que pode ser visualizado como flutuações rápidas no rastreamento de onda quadrada, então uma pequena quantidade de sucção é aplicada a pipeta patch para formar uma vedação entre o gigaohm pipeta e da membrana (causas de uma linha completa de flat-o traço onda quadrada; Figura 8B).
- O programa é então ligado ao modo de patch, e pipetar capacitância (visíveis como minúsculos blips de corrente nas bordas esquerda e à direita do traço plano atual; Figura 8B) é compensada com a compensação de capacitância pipeta no amplificador.
- Uma quantia pequena, mas afiada de sucção é aplicada a ruptura da membrana no patch e permitir o acesso do eletrodo para o interior da célula. Ruptura de membranas de sucesso é indicada pelo aparecimento de grandes transientes capacitivo também na esquerda e à direita bordas do traçado atual onda (Figura 8C). Uma vez que romper foi alcançado, o programa está ligado ao modo de células e indenização capacidade total da célula é ajustada no amplificador para remover os transientes capacitiva. Há um atraso de alguns minutos para permitir equilíbrio da solução de gravação intracelulares dentro da célula antes de gravar.
- Comandos de tensão são gerados e os dados são adquiridos usando um computador equipado com uma interface conversor Digidata 1440A analógico para digital em conjunto com pClamp10.1 software. Protocolos clamp única tensão são escritos para cada experimento, e estes são usados para gravar correntes canal iônico das células transfectadas. A Figura 9 ilustra as correntes de cálcio gravado a partir de uma célula HEK-293T expressando a invertebrados LCav3 dos canais de cálcio voltagem-dependentes. A célula foi realizada com uma tensão de-110mV, e despolarizações incremental entre-70mV e 20 mV foram tomadas para obter as correntes de cálcio para dentro.
- Correntes registradas são filtradas em 10 kHz usando um low-pass do filtro de Bessel e digitalizados em uma freqüência de amostragem de 2 kHz. Gravações apenas com vazamento mínimo (<10%) são utilizados para análise, e fora de vazamento de subtração é realizada através do software 10,1 Clampfit.
4,6 estudos Drogas de células gravadas
Drogas podem ser pipetados directamente o prato a ser gravada. Concentração de drogas pode ser calculada se o volume da droga adicionado e volume de solução de banho são conhecidos. Quantidades caro ou limitado de drogas também pode ser adicionado por microperfusão de um colector de multi-barril poliimida lápis de perfusão com uma ponta removível 250 micron, utilizando um canal de oito Smartsquirt pressão do sistema de perfusão micro (AutoMate Científica) ou sistema de fluxo de gravidade operado através de válvulas de Teflon e Valvelink8 controladores de válvula (AutoMate Científico; veja a Figura 5 para configurações do sistema de perfusão). Taxas de fluxo de sistemas microperfusão estão fixados em 0,1 ml por minuto em um fluxo de saída do lápis de perfusão 400 microns a partir da célula gravado. A distância da ponta do lápis perfusão da ponta do eletrodo de gravação deve ser consistente de patch para patch; A figura 10 ilustra uma distância sugeriu visível na ampliação de 40x. Taxas de fluxo adequado fornecer perfusão saturando da célula gravado. Antes de um experimento de drogas é realizada usando microperfusão, as células são equilibradas com a microperfusão de solução de banho de controle em um fluxo contínuo. O mínimo de interrupção do fluxo é evitado durante o experimento de troca rápida do banho de controle, droga ou solução de lavagem. Sucção montada na borda do prato de gravação pode ser usada to remover excesso de soluções, por meio de sucção manual com uma seringa ou usando um dispositivo de bomba peristáltica acionada (por exemplo, MINISTAR Miniature DC bomba peristáltica, Instrumentos de Precisão Mundial). Cuidados devem ser tomados desde a perfusão extremamente rápida induz forças de cisalhamento que podem alterar a corrente de cálcio (Peng et al. 2005), pode lavar a célula a ser gravada, e esgota o reservatório de droga muito rapidamente.
Pipetar diretamente no prato vs sistemas de perfusão
| Pipetagem direta | Micro sistema de perfusão | Gravidade sistema de perfusão de fluxo | |
| Volume necessário de drogas | Moderado | Baixo | Alto |
| Habilidade técnica | Baixo | Médio | Médio |
| O custo dos equipamentos | Baixo | Significativo | Significativo |
| Tempo diário para instalação e limpeza | Nenhum | 20 + minutos | 20 + minutos |
| Contaminação de equipamentos | Nenhum | Sim | Sim |
| Solução de problemas | Fácil | Complexo | Complexo |
| Drogas garantida no prato | Sim | Não | Não |
| Perder celular com a adição de drogas | Sim | Sim | Sim |
| Reduzir conc drogas. por lavagem | Difícil | Simples | Simples |
| Facilidade de fazer uma curva de resposta múltiplas doses | Abaixo do ideal | Simples | Simples |
| Reprodutibilidade dos resultados | OK - dependendo da localização da pipetagem | Bom | Bom |
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Discussion
Ser capaz de gravar toda célula correntes utilizando os protocolos descritos e soluções indica que a transfecção foi bem-sucedida e que o desejado dos canais de íon ou complexos de canal iônico estão presentes com quantidades significativas na membrana celular. Deve ser positivamente as células transfectadas (ie verde fluorescente), mas não têm correntes de gravação, tempo adicional a 28 ° C pode ser necessária para permitir a proteína de canal a ser devidamente embalados e inserida na membrana celular. Note-se que a incubação prolongada a 28 ° C faz com que células para separar a partir do lamínulas, e membranas desestabilizar e se acumulam restos de células mortas, tornando a gravação patch clamp mais desafiador. Todos os horários sugeridos neste protocolo foram otimizados para os nossos canais de particular. Outros canais e suas subunidades podem exigir períodos de incubação mais longos ou mais curtos, e nosso protocolo pode ser ajustado conforme a necessidade. Para certos canais eficiência de transfecção pobres (ou seja, menos células fluorescentes e menor intensidade de fluorescência por célula) produz melhores resultados do que eficiente transfectadas, as células altamente fluorescentes. Devem ser células fluorescentes, mas não têm correntes de gravação, os pontos de solução de problemas a serem considerados incluem: a falta de proteína acessório (s); indevida mistura de reagentes de transfecção; soluções sub-ótimas de gravação; e mutação / recombinação de canal ou canal subunidade constrói cDNA produzindo indevidamente dobrado ou não expressar canais.
Figura 1: Human embrionárias de rim 293T células (HEK-293T) são cultivadas em monocamadas aderente a 37 º C em incubadoras de CO2 (CO2 5%) em frascos de 25cm2 ventilada a 90% confluência e dividir em 1:12, 1:8 e 1:4 diluições. As células são tipicamente dividida bi-semanal, a partir de uma confluência ~ 90%. Para garantir uma semelhante a 90% na divisão de confluência, as células são divididas em uma diluição 1:08 às segundas-feiras, e 01:12 às quintas-feiras. Antes de transfecção, um frasco completamente confluentes é dividido 1:04 em um frasco novo, e as células podem se conectar a 37 º C em uma incubadora de CO2 por 3-4 horas.
Figura 2: Estratégia para a expressão heteróloga de canais iônicos em HEK-293T (Esquerda) cDNAs canal Ion são clonados no sítio múltiplo de clonagem do pIRES2-EGFP plasmídeo.. (Direito) Transfection dessas construções em resultados HEK células na produção de moléculas de mRNA que contém a codificação de canal iônico seqüência (vermelho) logo acima de um site interno ribossomo entrada (IRES; azul) ea seqüência de codificação eGFP (verde). Canais iônicos são traduzidos e transportados para a membrana celular através do sistema de ER e endomembrane, enquanto eGFP é traduzida e mantida no citoplasma.
Figura 3:. Transfecção e expressão de cDNAs ion heteróloga canal em HEK-293T células, e galvanoplastia de células em lamínulas para a gravação eletrofisiológico (A) (painéis Top) HEK-293T células incubadas a 28 C, quatro dias após a transfecção com o LCav3 canais de cálcio abrigou no vetor de expressão pIRES2-EGFP mamíferos CMV. (Painéis de fundo) As células acima tripsinizados e semeadas em lamínulas, isolado para a gravação eletrofisiológico. Microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC).
Figura 4:. A configuração do equipamento típico eletrofisiológicas gravação componentes rig eletrofisiológicos de gravação inclui um amplificador (A), um computador pessoal (PC), Digidata 1440A interface do conversor analógico-digital (C), motorizado, manipuladores pipeta dual (PM), um microscópio de epifluorescência (M), os sistemas de perfusão (P), TMC 63-500 série mesa de isolamento de vibração (VT), 40 de altura Tipo II Faraday Cage (FC), e um free-standing 19 metal, cremalheira elétrica (R).
Figura 5: sistemas de perfusão (A) Um sistema de fluxo de gravidade operado usando válvulas de Teflon e Valvelink8 controladores.. (B) de oito canais Smartsquirt pressão do sistema de perfusão micro. Multi-Barrel Dica Manifold de qualquer sistema de perfusão é montado em um manipulador motorizado.
Figura 6:. Polished pipetas, patch mostrado em 10x (esquerda) e 40x de ampliação (à direita) Patch pipetas foram gerados a partir de tubos de vidro de borosilicato com filamento capilar e fogo polidas para suavizar as superfícies ponta da pipeta. Um programa de pipeta-extrator foi otimizado para gerar pipetas que fez uma leitura de 2-5MΩ em nosso eletrofisiologia set-up.
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. Figura 7: eletrodo de terra e pipetas patch no prato de gravação patch pipeta (direita) e eléctrodos de terra (à esquerda; seta branca) em solução de gravação.
Figura 8:. PClamp10.1 telas ilustrando as etapas de fazer um patch (A) rastreamento de onda quadrada observou quando no modo de banho. (B) Um selo Gigaohm no modo de correção leva a um achatamento do traço de onda quadrada com uma pipeta capacitância visíveis como minúsculos blips de corrente nas bordas esquerda e à direita do traço plano atual. (C) Depois de descoberta e ao mesmo tempo no modo de células, grandes transientes capacitivo são vistos.
Figura 9:. Resultados Eletrofisiologia (Esquerda) Recordable dentro correntes de cálcio dependentes da voltagem indica sucesso transfecção e expressão heteróloga de canais iônicos (por exemplo, LCav3). (Direito), as células não têm Untransfected correntes gravável. As células foram submetidas a um protocolo de IV que especifica que o software segurar o celular em-110mV e depois passo para-70mV para 250msec depois volta para-110mV segurando potencial. Cada vez que o passo aumenta em 10mV para que as etapas são etc, para-70mV,-60mV até a última etapa é a +20 mV. Resultados são de um invertebrado tipo T (Cav3) homólogo do canal de cálcio voltagem-dependentes de L. stagnalis denominado LCav3.
Figura 10: Disposição dos eletrodos e lápis microperfusão em solução de gravação (A) pipetas patch trabalhada a partir de vidro de borosilicato (direita) e multi-poliimida barril ponta múltiplas para a perfusão de drogas (esquerda).. Eletrodo terra (costas) de vidro de borosilicato preenchidos com a 3M CsCl e 1,5% solução de agarose dobrado como hockey stick realizada em Titular microeletrodos Half-Cells. (B) vista através de um microscópio 40x da ponta do lápis perfusão e microeletrodo de gravação.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma subvenção de funcionamento Discovery para JDS da Ciências Naturais e Engenharia Research Council (NSERC) do Canadá, um NSERC Alexander Graham Bell Bolsas de Pós-Graduação no Canadá (doutorado) (para A. Senatore) ea Fundação do Coração e Derrame, Grant -In-Aid NA # 6284.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech Laboratories | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 - 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Micr–lectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments, Inc. | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige International | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).
- Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
